基于油酰乙醇胺的脂肪性肝炎新靶点机制及数据分析

施纯礼 邱慧青 钱馨蔚 (福建医科大学附属第一医院干部科，福建 福州 350004)

近年来，诸多研究表明非酒精性脂肪肝(NAFLD)和脂肪性肝炎(NASH)病理机制和白色脂肪组织的炎性反应关系密切〔1〕。过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)α可通过调控炎性基因的表达等抑制NASH。油酰乙醇胺(OEA)是一种具有调节脂代谢作用的内源性脂质。目前研究已证实〔2〕，OEA是PPARα受体的唯一高亲和力内源性配子，其通过激活PPARα减轻体重，降低血胆固醇及甘油三酯(TG)含量，油红染色表明OEA可纠正肝脏脂肪堆积。因此，基于OEA的内源性脂代谢调节作用，开发一种疗效显著且安全的调节脂类代谢和缓解肝脏脂肪性病变的药物成为可能。本研究从细胞水平探析基于OEA的NASH新靶点机制。

1 资料与方法

1.1材料 人体肝肿瘤细胞株HepG2细胞(来源于上海基免实业有限公司)。OEA(上海居里生物试剂检测中心)，高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均来源于美国Gibco公司，DMSO(美国Invitrogen公司)，医用脂肪乳注射液(山东鲁抗辰欣药业)，非诺贝特、MTT、苏木素、焦碳酸二乙酯(DEPC)、油红O均来源于美国Sigma公司，总RNA抽提试剂Trizol(美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒(日本 Toyobo公司)，PCR引物(上海基免实业有限公司)，TG测定试剂盒(北京北化康泰公司)。细胞培养板(美国corning公司)，ThermoForma细胞培养箱、超净工作台(均来源于苏州净化设备公司)，Olympus倒置显微镜(日本Olympus公司)，快速恒温水浴箱、低速台式自动平衡离心机、低温高速离心机、UV-2000紫外分析仪均来源于上海精宏实验设备公司，DU800核酸蛋白分析仪(美国Beckman coulter公司)，荧光酶标仪、JY3000+型多用途电泳仪均来源于美国Molecular Devices公司，微量移液器(德国Eppondorff公司)，血细胞计数板、sartorius天平均来源于杭州纳德科技有限公司，pH试纸(杭州特种纸业有限公司)。

1.2试剂配制 ①DMEM培养基:将已灭活的10%胎牛血清加于高糖DMEM培养基中，4℃保存。②配制细胞冻存液:(灭活胎牛血清:DMSO)=9∶1进行配制。③配制PBS缓冲液:将8.0 g NaCl、1.4 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4及0.2 g KCl溶解于1 L超纯水中，调节pH值至7.2～7.4，灭菌，4℃保存。④配制胰蛋白酶:将0.25 g胰蛋白酶和0.01 g乙二胺四乙酸溶解于100 ml PBS溶液中，抽滤，灭菌，－20℃保存。⑤配制MTT:将25 mg MTT溶解于0.01 mol/L的5 ml PBS中，过滤，灭菌，备用。⑥配制油红O染色液:将0.5 g油红O溶解于100 ml异丙醇中，在60℃水浴锅中振荡30 min，过滤，4℃密光保存，待用时，预热，染色时现配60%油红O异丙醇染色液。⑦配制苏木素染色液:取5 g苏木素溶解于50 ml无水酒精中，待用;将100 g硫酸铝钾溶解于2 000 ml的三角烧瓶中，加热溶解，待温度达到90℃时，加入已制的苏木素，待变为紫红色时，加入2.5 g氧化汞，变为深紫色时，将三角瓶置于冰水中，避光，第2天过滤，加入40 ml冰醋酸，备用。⑧配制甲醛固定液:将10 ml 40%的甲醛溶解于90 ml双蒸水中，加入1.1 g氯化钙，调节pH至7.0。⑨配制溴乙锭(EB):取1 g EB溶解于100 ml DEPC·H2O中，置于棕色瓶中室温下保存。⑩非变性琼脂糖凝胶:将0.2 g Agarose加入至20 ml硼酸(TBE)中，微波加热，冷却至60℃ ～70℃加入2.5 μl EB，均匀混合倒入至胶板中，自然冷却，备用。

1.3建立稳定的体外脂肪肝细胞模型 采用含有10%胎牛血清的DMEM培养HepG2细胞，以不同浓度油酸处理HepG2细胞24、48、72 h，以不加油酸的HepG2细胞为空白对照组;使用MTT试验测定细胞活力，生存率，细胞分化活性;结合油红染色，在光镜下观察细胞形态，确认脂肪肝细胞的形成;测定细胞内TG含量，筛选出脂肪乳诱导HepG2细胞形成脂肪肝细胞的最佳浓度和时间。

1.4OEA 作用 以 OEA(10、20、50、100 μmol/L)和非诺贝特(50 μmol/L)处理HepG2脂肪肝细胞，在不同的时间窗口(6、10、12 h)收集细胞，测定TG浓度;取RNA，使用定量PCR方法测定以下基因表达水平:PPARα、固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1c、去乙酰化酶(SirtI)、肉碱棕榈酰转移酶I(CPTI)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、乙酰辅酶A羧化酶(ACC);提取蛋白，使用Western印迹方法检测PPARα、SREBP-1c、SirtI、CPT-I、LPL、TNFα、ACC 的表达水平。

1.5统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1油酸诱导HepG2细胞脂肪形成脂肪肝细胞的最佳浓度含≤0.25 mmol/L油酸的培养液培养 HepG2细胞24、48、72 h，细胞活力未见明显下降，且不影响分裂、生长，油红O染色及TG最高含量测定，当0.125 mmol/L浓度油酸造模培养24 h时，细胞内脂滴蓄积较少，因此，致NAFLD和NASH的最佳浓度为0.25 mmol/L油酸。

2.2各浓度油酸对细胞活力的影响 (1)对细胞活性和形态的影响:含≤0.25 mmol/L油酸的培养液对细胞活性无明显影响;0.125 mmol/L油酸造模可见HepG2细胞边缘清晰，但大部分为多角形，仅少量变圆;0.25和0.5 mmol/L油酸造模显示细胞边界不清晰，变圆，结合不紧密;≥1.0 mmol/L油酸造模细胞活性较少，见表1。(2)细胞模型TG含量:含0.25 mmol/L油酸组TG含量〔(5.516±0.262)mg/dl〕显著高于空白对照组〔(1.260 ±0.104)mg/dl〕(P ＜0.05)。

表1 不同浓度油酸对细胞活性的影响(s)

表1 不同浓度油酸对细胞活性的影响(s)

与空白对照组比较:1)P＜0.05

组别 OD 活性变化(%)抑制率(%)0.125 mmol/L 1.006±0.037 98.9 1.0 0.25 mmol/L 0.942±0.024 92.6 8.0 0.5 mmol/L 0.885±0.0311) 86.7 16.0 1.0 mmol/L 0.846±0.0221) 83.2 18.0 1.5 mmol/L 0.728±0.0241) 71.4 29.0 2.0 mmol/L 0.601±0.0441) 59.3 41.0空白对照组1.017±0.025 － －

2.3不同浓度OEA处理模型12 h后细胞TG含量10 μmol/L 组，(4.237 ±0.128)mg/dl，20 μmol/L 组，(3.936 ±0.196)mg/dl，50 μmol/L 组，(3.348 ± 0.238)mg/dl，100 μmol/L 组，(3.493 ±0.222)mg/dl，50 μmol/L 非诺贝特组，TG 含量(3.458±0.245)mg/dl。各种浓度OEA模型的TG含量均显著高于空白对照组(0.728±0.024)mg/dl(P＜0.05)。

2.4不同浓度OEA对基因表达的影响 50 μmol/L时，OEA可提高 PPARα、SirtI、CPT-I及 LPL 表达，降低 SREBP-1c、TNFα及ACC表达(P＜0.05)，见表2。

表2 不同浓度OEA对基因表达的影响(s)

表2 不同浓度OEA对基因表达的影响(s)

与空白对照组比较:1)P＜0.05

4.492±0.399 20 μmol/L 1.007±0.2311) 1.824±0.201 0.480±0.013 2.507±0.092 0.016±0.0011)0.000 2±0.000 21) 3.924±0.421 50 μmol/L 1.195±0.2391) 0.705±0.0751) 0.617±0.0581) 2.929±0.1121) 0.018±0.0011)0.000 3±0.000 11)1.765±0.5011)100 μmol/L 1.199±0.2381) 0.700±0.0741) 0.619±0.0571) 3.034±0.1151) 0.019±0.0011)0.000 3±0.000 11)1.741±0.5221)空白对照组 0.638±0.121 2.268±0.149 0.412±0.008 1.738±0.058 0.008±0.001 0.001 8±0.000 1 4.663±0.085非诺贝特组 0.926±0.2691) 1.771±0.194 0.390±0.001 2.940±0.1151) 0.009±0.001 0.000 4±0.000 11)3.022±0.2841)ACC 10 μmol/L 0.834±0.2271) 2.006±0.270 0.448±0.012 2.426±0.088 0.014±0.0011)0.000 2±0.000 11)组别 PPARα SREBP-1c SirtI CPT-I LPL TNFα

3讨论

脂肪肝是慢性肝病及肝硬化等疾病最常见的病因。流行病学资料显示，肥胖人群中脂肪肝患病率高达74%〔3〕。由于NAFLD和NASH的病理机制均与白色脂肪组织的炎性反应关系密切，同时靶点于肝脏细胞及脂肪细胞对探讨NASH发病机制，预防肝硬化具有重要意义，可为从始动环节有效治疗NAFLD和NASH奠定理论基础。PPARα是一类核受体，由配子激活，主要分布在肝、肠黏膜、肾皮质及心脏等部位，可直接参与脂代谢等〔4〕。在肝脏中，PPARα可通过促进脂代谢、氧化反应，促进溶脂反应及抗炎症作用，促进脂肪代谢〔5，6〕。PPARα可抑制TG含量，升高CPT-I、LPL含量及降低ACC的表达，促进脂肪代谢〔7〕。此外，PPARα还可直接调控炎症基因的表达。OEA是一种内源性脂质，由18碳组成，具有调节脂代谢的作用。OEA可通过激活PPARα发挥减轻体重和降低血胆固醇及TG含量的作用，可纠正肝脏脂肪堆积。动物实验表明〔8〕，OEA对高脂血症的血脂调节主要是通过激活PPARα通路。

本研究与相关研究结果证实，油酸刺激HepG2细胞后，可增加载体蛋白B含量，建立脂肪肝细胞模型〔9〕。本文提示当过多的脂肪酸进入到肝细胞中时，合成TG能力增加，与相关研究结果一致〔10〕。本文提示OEA可明显降低TG水平，具有解脂作用，与相关动物实验结果一致〔11〕。OEA具有减少高浓度脂肪酸环境中脂滴形成的作用，OEA作为PPARα的内源性高效激动剂，可提高LPL的表达，从而促进TG水解，抑制SREBP-1c及ACC的表达，抑制脂肪酸再合成〔12〕，从而治疗NASH。OEA还可激活下游基因SirtI和CPT-I的表达，发挥肝脏保护作用〔13〕，并抑制炎症因子TNFα的表达，激活PPARα通路，达到治疗目的。

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