ACE及AGT基因多态性与糖尿病肾病发病风险的关系

刘品力 陈燕玲 (河北医科大学第二医院内分泌科，河北 石家庄 050000)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)患者最常见并发症之一，且为导致终末期肾脏病的第二原因〔1〕。对于DN发病机制，目前尚未有明确的结论。肾素-血管紧张素(RAS)系统参与机体血压调控及组织液平衡，而DN患者体内常存在RAS系统激活异常〔2〕。血管紧张素转换酶(ACE)为RAS系统中的关键酶，而编码ACE基因中第16内含子可因出现片段的插入或缺失构成基因多态性〔3〕。研究〔4〕表明，ACE基因多态性与DN发病风险之间的关联在不同种族及环境中表现出不同倾向。本文选择ACE与AGT基因研究其与DN发病风险之间的关联，后者为编码血管紧张素原基因，且其第2外显子常出现变异导致编码产物氨基酸出现替换〔5〕。本研究旨在研究ACE及AGT基因多态性与DN发病风险之间是否存在关联。

1 资料与方法

1.1入组标准 DM组:均符合1997年美国糖尿病协会(ADA)T2DM诊断标准〔6〕，患者间无血缘关系，且无高血压病史或心血管疾病家族史。DN(+)组:符合T2DM诊断标准，尿蛋白阳性，3次尿微量白蛋白排泄率(uAE)有2次或以上＞20 μg/min，眼底检查存在DM性视网膜增殖，以上条件需同时符合。DN(-)组:符合T2DM诊断标准，尿蛋白阴性，3次检查均为uAE＜20 μg/min，以上条件需同时符合。对照组:无DM、高血压、冠心病、肾病及无糖尿病家族史，以上条件需同时符合。

1.2一般资料 选择2008年3月至2012年3月我院收治的2型糖尿病(T2DM)患者。纳入患者均符合DM组入组标准，符合DN(+)组入组标准的100例患者纳入DN(+)组。同时从符合DN(－)组入组标准患者中按同性别、同年龄1∶1配对选取100例编入DN(－)组。DN(+)组与DN(－)组共同构成DM组。同时从我院同一时间段体检中心符合对照组入组条件的健康者中随机抽取200例编入对照组。

1.3检测方法 (1)样本提取:检测DNA样本来源于提取检测对象外周静脉血3 ml，常规肝素抗凝后，采用酚/氯仿法从外周血白细胞内提取基因组DNA。(2)ACE基因I/D多态性检测及分析:对提取样本DNA扩增ACE基因16内含子。引物为 P1:5’-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3’;P2:5’-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3’。反应总体系为25 μl。PCR反应条件:94°C下预变性5 min后进入循环，循环为按94°C变性1 min，58°C退火1 min，72°C延伸2 min，共30个循环后，在72°C下延伸5 min，4℃下保存。取扩增后产物10 μl于2%琼脂糖凝胶中电泳分析，溴乙啶染色，并以DNA Marker作为标准分子量进行对照。(3)AGT基因M235T多态性检测及分析:对提取样本DNA选择扩增AGT基因第2外显子。引物为P1:5’-CCA GGG TGC TGT CCA CAC TGG CTC CGG-3’;P2:5’-AAG TGG ACG TAG GTG TTG AAA GGG AGG GGT GCT GTC CCA CAC TGG CTT CAA-3’;P3:5’-TGT GGT CCT CCC ACG CTC TCT GG-3’。反应体系 25 μl，PCR反应条件:94°C下预变性6 min后，循环为按94°C变性1 min，62°C退火1 min，72°C延伸1.5 min，共36个循环后，在72°C下延伸5 min。取扩增后产物6 μl于12%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分析，并以DNA Marker作为标准分子量进行对照。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行t检验、Hardy-Weinberg检验、c2检验。

2 结果

2.1 遗传平衡检验 DN(+)、DN(-)及对照组ACE及AGT分布的观察值与预期值之间差异无统计学意义(P＞0.05)，符合遗传平衡定律。见表1，表2。

表1 ACE基因遗传平衡检验结果(Hardy-Weinberg遗传平衡检验)

表2 AGT基因遗传平衡检验结果(Hardy-Weinberg遗传平衡检验)

2.2 ACE基因多态性分析 ACE基因型分为三种:Ⅱ型(ACE基因插入纯合型):仅显示490 bp单条区带;DD型(ACE基因缺失纯合型):仅显示196 bp单条区带;ID型(ACE基因插入/缺失杂合型):同时显示196 bp与490 bp两条区带。DN(+)与DN(－)组基因型分布频率无统计学差异(P＞0.05)，而DM组与对照组基因型分布频率差异显著(P＜0.01);ACE等位基因对比，DN(+)与DN(－)等位基因D/I频率无统计学差异(P＞0.05)，而DM组D频率明显高于对照组(P＜0.01)。见表3。

表3 ACE基因多态性分析结果〔n(%)〕

2.3 AGT基因多态性分析 AGT基因型分为:TT型(AGT纯合型):仅显示134 bp单条区带;MM型(AGT纯合型):仅显示156 bp单条区带;MT型(AGT杂合型):同时显示134 bp与156 bp两条区带。AGT基因型分布统计结果显示，DN(+)与DN(－)在AGT基因型分布频率上差异无显著性(P＞0.05)，两组在AGT等位基因频率上无显著差异(P＞0.05);DM组与对照组在基因型分布频率上差异无显著性(P＞0.05)，两组等位基因频率无显著差异(P＞0.05)。见表4。

表4 AGT基因多态性分析结果〔n(%)〕

2.4ACE与AGT基因联合多态性分析 DM相对于对照组ACE基因OR值为2.000(95%CI 1.061～3.770);而在DN(+)与DN(-)中，两者分别与对照组相比，OR值较为接近，分别为2.355(95%CI 1.135～4.889)与2.029(95%CI 0.959～4.296)，缺少DD与DN(+)之间存在明显联系证据。AGT中，DN(+)、DN(-)及 DM组与对照组相比，OR值接近1，OR=1.521，1.092，1.282;95%CI 0.897 ～ 2.577，0.659 ～ 1.808，0.845～1.945，AGT多态性与DM或DN间联系较弱;ACE与AGT基因联合多态性分析结果显示，DD+TT基因型对于DN(+)OR值为4.042(95%CI 1.717～9.515)，DD+TT对于DN(-)OR值为3.171(95%CI 1.306～7.698)，对于DM组 OR值为3.599(95%CI为1.657～7.818)，即同时具有ACE-DD型与AGT M235T-TT型基因，发生T2DM及DN危险度均升高。

3讨论

随着分子生物学的进展及对DN发病机制的深入研究，目前较为一致的观点认为，DN为多因素参与，多基因遗传因素及环境因素共同作用的疾病。在遗传因素上，许多研究表明DN存在种群分布及家族分布差异〔7〕。而DN早期，肾脏血流动力学已表现出异常。由于ACE为RAS中的关键酶。无活性的血管紧张素Ⅰ在ACE作用下C-末端水解去除2个氨基酸残基，产生有活性的血管紧张素Ⅱ，同时灭活缓激肽。血管紧张素Ⅱ可通过激动血管紧张素受体1(AT1)，引起血压上升、静脉收缩、刺激醛固酮合成及释放，促进对Na+重吸收等。因此ACE基因多态性与DN遗传因素之间是否存在关联常作为研究DN遗传因素的起点〔8〕。由于ACE基因位于染色体17q23上，而第16内含子在不同人群中存在一个287 bp的插入或缺失，从而表现出I/D多态性。因此考虑ACE基因I/D多态性与DN发病之间是否存在关联。然而已有研究结果表明，对于不同人群研究中，结论并未统一〔9〕。研究认为，在欧洲白种人中，ACE基因I/D多态性与血浆ACE水平存在关联，为DN发病的危险因素〔10〕。而对于亚洲人种研究中，ACE基因I/D多态性与DN发病之间存在多种结论〔11〕。

本研究结果提示，ACE基因多态性可能与T2DM发病之间存在关联，但无直接证据表明ACE基因多态性与2型DN发病之间存在直接关联。

综上所述，由于考虑到DN可能受多基因遗传因素控制〔12〕，而AGT可生成无活性血管紧张素Ⅰ，且人AGT基因第2外显子变异导致其编码产物中氨基酸出现替换〔13〕。本研究提示同时具有ACE-DD型与AGT M235T-TT型基因，发生T2DM及2型DN危险度均升高。

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