高糖对大鼠腹膜间皮细胞HMGB-1/RAGE信号通路表达的影响

陈 硕 王二敏 周红丽 (辽宁医学院附属第一医院肾内科，辽宁 锦州 121000)

长期腹膜透析可引起腹膜纤维化并最终导致透析失败。研究发现，腹膜透析液的生理不相容性因素特别是高糖，一方面直接损伤腹膜间皮细胞(PMC)并抑制其增殖，另一方面通过影响PMC产生多种细胞因子干扰细胞外基质的代谢，导致其产生增多，降解减少，最终导致了腹膜纤维化的形成〔1，2〕。目前关于腹膜透析相关性腹膜纤维化的治疗是研究的热点之一。高迁移率簇蛋白-1(HMGB-1)是新发现的具有显著促炎效应的细胞因子。糖基化终产物受体(RAGE)即晚期糖基化终末产物受体是HMGB-1明确的高亲和力受体，已有研究发现，HMGB-1与RAGE结合激活NF-κB信号转导系统，通过EMT及分泌肿瘤坏死因子(TGF-β)最终致肺纤维化〔3〕。但目前国内外尚无HMGB-1/RAGE通路在PMC上的研究，我们通过建立体外大鼠培养模型，研究高糖对PMC HMGB-1、RAGE和TGF-β1的影响及三者之间可能存在的关系，进一步探讨高糖介导腹膜损伤和腹膜纤维化发生的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级雄性SD大鼠，质量(160±20)g，辽宁医学院实验动物中心提供。

1.2药品和试剂 DMEM/F12干粉培养基(美国Gibco公司);标准胎牛血清(天津灏洋生物有限公司);胰蛋白酶(美国Invitrogen公司);D-葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司);Trizol试剂(大连宝生物);两步法RT-PCR试剂盒(杭州博日);PCR引物由上海生物工程有限公司合成;大鼠HMGB-1 ELISA试剂盒(美国ADL公司);大鼠TGF-β1 ELISA试剂盒(武汉博士德公司);兔抗大鼠RAGE抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.3PMC的原代培养、传代与鉴定 参考文献〔4〕进行。

1.4实验分组 第3代PMC达80%融合时进入实验。用含2%胎牛血清培养液培养24 h使细胞同步化。随机分组:①正常对照组:只加2%胎牛血清DMEM/F12培养基;②葡萄糖组:不同浓度葡萄糖(1.5%、2.5%、4.25%)培养36 h;2.5%葡萄糖分别作用于PMC 24、36、48 h组。24孔板设四复孔。

1.5RT-PCR法检测RAGE mRNA的表达 采用Trizol一步法进行总RNA的抽提，采用RT-PCR试剂盒行逆转录PCR，25 μl PCR反应体系，RAGE、GAPDH的特异性引物行PCR扩增，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，并用计算机处理图像进行光密度扫描，以GAPDH产物吸光度(A)为参照。PCR引物:GAPDH上游:5 ＇-GGCAAGTTCAATGGCACAGT-3 ＇;下 游:5 ＇-AAGGTGGAGGAATGGGAGTT-3 ＇(725 bp);RAGE 上 游:5 ＇-ATGAGCAGAGCGGCTATTCC-3＇;下游:5＇-CACGCTTCGGTCAGAGCTCA-3＇(513 bp)。PCR反应条件:GAPDH为95℃预变性5 min;循环条件为95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，循环结束后72℃延伸10 min。RAGE mRNA为95℃预变性5 min;循环条件为94℃变性40 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30个循环，循环结束后72℃延伸10 min。

1.6Western印迹法检测RAGE蛋白表达 用细胞裂解法提取总蛋白，总蛋白上样于12%SDS-PAGE胶电泳分离，电转移至PVDF膜上，以含5%脱脂奶粉的TBST封闭60 min后，加入兔抗大鼠 RAGE抗体(1∶200)，小鼠抗大鼠 GAPDH抗体(1∶1 000)，4℃ 孵育过夜，TBST 洗膜 3 次，二抗稀释液(1∶1 500)，室温孵育2 h，洗膜3次，ECL显影，扫描仪成像，自动成像系统分析。

1.7ELISA法检测细胞培养液中HMGB-1和TGF-β1蛋白表达 24孔板细胞经干预后，收集上清，离心后弃沉淀，采用ELISA试剂盒根据其说明进行蛋白质含量测定，最后在酶标仪450 nm处即刻测OD值并计算其浓度。

1.8统计学方法 采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1葡萄糖刺激下PMC RAGE mRNA表达的变化 在葡萄糖刺激下PMC的RAGE mRNA和蛋白表达显著上调，呈剂量依赖性。与正常对照组比较，组间差异均有统计学意义(均P＜0.05)，见图1，表1。2.5%葡萄糖刺激PMC后0～48 h内随着作用时间的延长，RAGE mRNA和蛋白表达增加，呈时间依赖性，与0 h组比较，组间差异具有统计学意义(均P＜0.05)，见图 2，表 2。

2.2高糖刺激下PMC HMGB-1表达的变化 结果显示2.5%葡萄糖刺激 PMC 0、24、36、48 h，HMGB-1 蛋白表达依次为3.66 ±0.598 9、24.48 ±2.480 4、34.10 ±2.180 4、42.34 ±2.588 6(μg/L)，其蛋白含量显著增加，呈时间依赖性，与0 h组比较，组间差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。

2.3高糖刺激下PMC TGF－β1表达的变化 结果显示2.5%葡萄糖刺激 PMC 0、24、36、48 h，TGF － β1蛋白表达依次为97.12 ±5.072 7、492.10 ±16.435 5、528.72 ± 15.649 4、671.03±21.794 3(ng/L)，其蛋白表达显著上调，呈时间依赖性，与0 h组比较，组间差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。

图1 不同浓度葡萄糖刺激PMC后RAGE mRNA、蛋白的表达

表1 不同浓度葡萄糖刺激PMC后RAGE mRNA和蛋白质表达(x ± s，n=5)

图2 2.5%葡萄糖LPS刺激PMC不同时间后RAGE mRNA及蛋白的表达

表2 2.5%葡萄糖刺激PMC不同时间后RAGE mRNA和蛋白质表达(x ± s，n=5)

3讨论

维持腹膜透析功能、延长透析时间是近年来对腹膜透析疗法研究的热点，其中关键问题是对腹膜纤维化的预防和治疗。腹膜透析液中的高浓度葡萄糖是引起腹膜炎性改变和腹膜纤维化的重要原因之一。有研究表明，高糖可以促进PMC表达白细胞介素(IL)-1、IL-6、TGF-β 等炎性介质〔5，6〕，造成局部炎症状态。而这些促炎细胞因子可通过引起腹腔白细胞聚集以及促进PMC和腹膜成纤维细胞合成细胞外基质(如透明质酸)等途径来影响腹膜的结构与功能，导致腹膜纤维化。因此体外培养PMC使之暴露于实验因素下，观察其表达、分泌细胞因子情况是进行抗腹膜纤维化研究的一个重要手段。

HMGB-1是新近发现的一种重要的促炎介质，在炎症反应性疾病的病理过程中具有重要作用。随着对HMGB-1研究的不断深入，发现其不仅在细胞核内基因的组装、转录、修复中起重要作用，而且它被释放到胞外时可作为一种有效的炎症介质诱发和进一步扩大炎症反应的发生。研究显示RAGE与HMGB-1具有高亲和力，是HMGB-1的主要受体〔7〕。RAGE为一种跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族。RAGE广泛分布于多种细胞表面，在类风湿性关节炎、炎性肾病、动脉硬化等多种疾病都与RAGE受体表达上调有密切关系〔8〕。现有证据表明HMGB-1的促炎效应大部分是通过RAGE起作用的，HMGB-1与RAGE的相互作用能活化两条信号通路，一条涉及Rac和Caco-2途径，导致细胞骨架重建;另一条涉及Ras-MAPK途径和随后NF-κB移位介导的炎症反应。本研究结果显示，在正常PMC仅有少量RAGE表达，在高糖作用下RAGE表达上调，并呈时间及剂量依赖性，表明高糖可激活PMC的RAGE信号转导通路，而高糖又可诱导RAGE的配体HMGB-1表达，高糖与HMGB-1协同作用进一步扩大炎症反应，并上调TGF-β1的表达，促进腹膜纤维化的发生。这些研究结果为针对HMGB-1靶点的抗腹膜纤维化治疗提供依据和思路。由于PMC激活过程复杂，受多种因素的影响，细胞因子信号在转导过程中，形成错综复杂的信号传输网络，HMGB-1通过RAGE激活PMC的信号通路，及相关因素之间的相互影响还待进一步研究。

总之，本实验初步阐明了葡萄糖可激活 PMC HMGB-1/RAGE信号通路，并可上调TGF-β1的表达，导致腹膜损伤。因此，早期切断细胞因子间的"交叉对话"，减少这些细胞因子生成或阻断其与受体结合及受体后信号传导通路，对临床防治腹膜纤维化具有重要意义。

1 Witowski J，Wisniewska J，Korybalska K，et al.Prolonged exposure to glucose degradation products impairs viability and function of human peritoneal mesothelial cells〔J〕.J Am Soc Nephrol，2001;12(11):2434-41.

2 刘 军，姚 建，吴开胤，等.高糖对人腹膜间皮细胞间粘合连接复合体的影响〔J〕.肾脏病与透析肾移植杂志，2002;11(1):27-32.

3 Mei He，Hiroshi Kubo，Kota Ishizawa，et al.The role of the receptor for advanced glycation end-products in lung brosis〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007;293:1427-36.

4 李丽燕，马健飞，李志明，等.罗格列酮对肽聚糖作用下大鼠腹膜间皮细胞 Toll样受体2表达的影响〔J〕.中华肾脏病杂志，2008;24(7):513-4.

5 Yao Q，Ayala ER，Qian JQ，et al.A combination of a PPAR-gamma agonist and an angiotensinⅡreceptor blocker attenuates proinflammatory signaling and stimulates expression of Smad 7 in human peritoneal mesothelial cells〔J〕.Clin Nephrol，2007;68(5):295-301.

6 Rieu P.End stage renal failure is a chronic inflammatory disease〔J〕.Nephrologie，2003;24(7):329-33.

7 Klune JR，Dhupar R，Cardinal J，et al.HMGB1:endogenous danger signaling〔J〕.Mol Med，2008;14(7-8):476-84.

8 Sorci G，Riuzzi F，Giambanco I，et al.RAGE in tissue homeostasis，repair and regeneration〔J〕.Biochim Biophys Acta，2013;1833(1):101-9.