荧光光谱法测定大鼠肝组织中丙二醛含量的方法改进

赵 颖 朱宝亮 李冬芹 宋晓雯 李庆周 范晴晴 (济宁医学院生物科学系，山东 日照 276800)

研究表明，脂质过氧化作用在许多疾病发病机制中起着一定作用〔1，2〕。丙二醛(MDA)是机体内的氧自由基攻击生物膜中不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化物，它能使DNA、膜蛋白、酶等发生交联反应，增加膜通透性，导致细胞膜结构、功能和代谢发生改变，对机体造成损伤甚至死亡〔3〕。对MDA的准确测定可反映机体内脂质过氧化的程度，从而指导人们对机体的受损程度或耐受程度进行正确的评价，有助于医学、生物学、药理及工农业生产的发展〔4〕。目前MDA测定方法主要有分光光度法〔5〕，荧光法〔6〕，HPLC 法〔7〕，GC-MS 法〔8〕，试剂盒法。HPLC法、GC-MS由于仪器昂贵而难以普及;试剂盒法对多个样品测定不经济;分光光度法虽然操作简便，但是测量结果不精确。本文采用一般实验条件可操作的硫代巴比妥酸(TBA)荧光分光光度法。由于肝脏中含有本底的干扰〔9，10〕，因而本文对荧光法微量精确测定肝脏MDA的实验条件及相关试剂进行了改进，测量正常和高脂的大鼠肝脏中MDA的含量，以期找到适用于一般实验室对肝组织MDA含量微量差异的测定方法。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 0.9%生理盐水，丙酮，5%三氯乙酸，95%乙醇，无水乙醇，1%硫酸，硫代巴比妥酸(TBA，98%，北京百灵威科技有限公司)，2，6，-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT，99.8%，北京百灵威科技有限公司)，1，1，3，3-四乙氧基丙烷(TEP，97%，北京百灵威科技有限公司)，正丁醇，吡啶。实验用水为二次蒸馏水，无荧光杂质。AR1140型电子分析天平(美国奥豪斯公司)，5810(R)高速冷冻离心机(德国eppendorf公司)，恒温水浴箱(天津艾维欧公司)，F-4600荧光分光光度计(日本日立公司)，手术剪，研钵等。

1.2动物分组及处理 选用8周龄雄性SDS大鼠12只，随机分为对照组、高脂饮食组(HL组)，每6只一笼。饲养5 w，饲养条件参照文献〔11〕。

1.3鼠肝匀浆的制备及去糖 大鼠禁食过夜，次日颈椎脱臼处死，开胸，剖开腹腔，用4℃生理盐水清洗肝脏，用滤纸吸干表面水分，称肝重，加入四倍肝脏重的0.9%的生理盐水，在研钵中研磨成匀浆，低温冷冻离心，3 000 r/min，15 min，取上清，转移至另一心管，加入等体积95%的乙醇，再次低温冷冻离心，3 000 r/min，15 min，取上清，即得去肝糖原的肝匀浆上清。

1.4MDA标准液的制备 取23.9 μl TEP于10 ml具塞试管内，用1% 硫酸稀释至100 ml刻度，室温放置120 min后为10 mmol/L MDA贮备液。置冰箱4℃保存备用。用水稀释成100 μmol/L MDA溶液即为校准曲线用工作液。该溶液于5℃下贮存可稳定8 d。0测定前用水稀释为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 的系列标准溶液。

1.5标准曲线的绘制 分别取MDA标准液200 μl置于具塞离心试管内，加入20 μl BHT(20 g/L，溶于无水乙醇)，再加入1.5 ml TBA(0.35%TBA与5%TCA以2∶1体积比在临用前混合)，震荡1 min，100℃水浴1 h，至冰上终止反应，加入2.5 ml正丁醇吡啶(15∶1)萃取液，充分振摇1 min，3 000 r/min离心15 min，取上清，转移至另试管中，以激发波长为530 nm，发射波长为553 nm测定荧光强度，测量三次取平均值。此过程设置标准对照组，除置室温替代100℃水浴外，其他条件均相同。以标准液浓度C(μmol/L)为横坐标，以标准管与标准对照管荧光强度之差△F0为纵坐标，用最小二乘法计算得回归方程和相关性为:Y=205.04x+27.386，R2=0.9947 ，P ＜0.001 说明线性关系良好。

1.6样品含量的测定 除用去糖的肝匀浆替代MDA标准液外，其操作同1.4。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0软件进行方差分析。

2结果

将 1.0 μml/L、2.0 μmol/L、3.0 μmol/L 的 MDA 标准液分别在90℃、95℃和100℃下和TBA反应。100℃时的测定值的直线斜率最大(图1)。因此，本实验选用100℃。

表1 两组肝匀浆反应液荧光强度及MDA浓度(n=6)

图1 不同温度和浓度峰值之间的关系

3讨论

本文将被测样品和TBA呈色以后的红色缩合物放置室温(25℃)每隔10 min测定荧光值1次红色缩合物在2 h内稳定。但日光直接照射可使颜色逐渐减退，因此，在实验操作过程中应尽量避光。TBA法受到最主要的干扰因素就是组织内的可溶性糖，而肝脏中大量的肝糖原在测定时降解为葡糖糖，因而如果不去除糖原本底的干扰，就不能正确地反映机体脂质过氧化损伤的水平。由于糖原不溶于乙醇，且乙醇作为一种较为温和的有机溶剂，本身不会对MDA含量测定产生影响，因此利用乙醇使混合物中的糖原沉淀出来。本实验采用95%的乙醇去除肝糖原，比较除糖前后测定MDA的结果发现，除糖前的含量明显高于除糖后的含量，平均高20%左右，而实际上高出的部分为肝脏中肝糖原所产生，测得的值并不是MDA的真实含量，从而干扰测定的准确性。

将TBA配成0.2%、0.25%、0.3%、0.35%和0.4%四种浓度，分别与10 μmol/L MDA标准液呈色，所测荧光峰高分别为1 700、1 936、2 013、2 246 nm 和 2 247 nm，说明 0.2%TBA 值明显偏低，而＞0.35%TBA数值无明显变化，但当TBA浓度超过0.4%时不易充分溶解，故本实验选用0.35%TBA。TBA质量对实验结果影响较大。本文选用北京百灵威科技有限公司样品，为白色粉状。配制时先将蒸馏水煮沸后再加入TBA，以减少TBA加热时间，避免其自发水解而变为粉红色。TBA溶液配制以后须在1个月内使用，避光放置37℃水箱可延缓沉淀析出如有少量沉淀析出时，临用前复溶不影响检测结果。

正丁醇和嘧啶混合溶剂在试验中起到萃取 MDA和 TBA反应生成的粉红色络合物——三甲川的作用。在齐凤菊等测定血清中MDA含量时表明正丁醇嘧啶(15∶1)混合液萃取效果较单用正丁醇好。而溶剂比影响着对其的提取率。本实验中采用不同的溶剂比对同一样品不同体积进行萃取，发现在溶剂比为15∶1时，测定值的直线斜率最大，故正丁醇嘧啶(15∶1)在也作为测定肝脏中MDA含量较佳试验条件。

MDA的测定是一项研究过氧化脂质损伤的重要生化检测指标，而作为肝脏MDA的微量差异检测没有一套较实用、经济的系统方法。本文通过系列实验对传统的荧光硫代巴比妥酸法进行改进:分别对正常和高脂的大鼠肝组织匀浆液上清先用95%乙醇消除肝糖原的影响，再与0.35%的硫代巴比妥酸在100℃条件下反应，显色后用正丁醇吡啶(15∶1)混合液萃取，最后用F-4600荧光分光光度计以激发波长为530 nm，发射波长为553 nm测定其荧光强度，进而计算出肝组织中MDA的含量。改进后的方法灵敏度为204.9，适用于一般实验室对肝组织MDA含量微量差异的测定，可用于过氧化脂质损伤对肝脏影响的机制研究。

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