蓝莓花色苷对人脐静脉内皮细胞凋亡调控基因Bax、Caspase-3表达的影响

林 欢 冷吉燕 于 静 孟 霖 (吉林大学第一医院干部病房，吉林 长春 130021)

蓝莓花色苷是从蓝莓果实中提取的一种黄酮类化合物，具有抗氧化、清除自由基〔1〕、降血脂及对心血管系统保护作用〔2，3〕。随着细胞培养和免疫组化技术的发展，黄酮类植物化合物在多种代谢性疾病，如动脉粥样硬化(AS)、高血压、糖尿病等的作用机制研究也越来越深入。本实验拟利用观察蓝莓花色苷对血管紧张素(AngⅡ)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡及凋亡相关基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂 HUVEC(吉林大学白求恩医学院药理学实验室)、蓝莓花色苷(本课题组先期提取，并已经鉴定)、DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)、胎牛血清(FBS)(美国Hyclone 公司);AngⅡ、二甲基亚砜(DMSO)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，美国Sigma公司;磷酸盐缓冲液(PBS)。

1.2主要实验器材 低温高速离心机(美国Thermo公司)、超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、MCO-20AIC型二氧化碳培养箱(日本SANYO公司)、CKX41型倒置显微镜(日本Olympus公司)、流式细胞仪(美国BD公司)、细胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司)、细胞培养板96孔板(美国Corning公司)。

1.3HUVEC的培养、传代与鉴定 从液氮罐中取出装有HUVEC的冻存管，放入37℃水浴箱中不断摇晃，1 min内迅速解冻细胞悬液，随即于超净台内移入无菌离心管，加入2 ml DMEM高糖培养液，吹打均匀后，1 000～1 200 r/min离3～5 min，弃上清后，再加入DMEM高糖培养液2 ml，吹打成细胞悬液，种入含10%FBS的DMEM高糖培养液的25 ml培养瓶内，置于37℃含5%CO2孵箱中培养，次日可见细胞贴壁生长，换液。3～5 d长满瓶底90%，用0.25%胰蛋白酶消化、传代，传代后隔天换液，取对数生长期细胞为实验对象。用Ⅷ因子相关抗原(SP免疫细胞化学染色法)检测阳性鉴定为内皮细胞。

1.4实验细胞分组及预处理 培养瓶中HUVEC生长至60%左右融合，换无血清培养液培养24 h，使细胞同步化，细胞分组处理:(1)空白对照组(Control):HUVEC用含10%FBS+DMEM高糖培养液培养。(2)AngⅡ组:HUVEC分别用10－9、10－8、10－7、10－6、10－5、10－4mol/L AngⅡ +10%FBS+DMEM高糖培养液培养。(3)蓝莓花色苷组:HUVEC分别用80、40、20、10、5、2.5 μg/ml蓝莓花色苷 +10%FBS+DMEM 高糖培养液培养。(4)AngⅡ+蓝莓花色苷组:HUVEC在含有20 μg/ml蓝莓花色苷的培养液中孵育2 h后，再加入10～6 mol/L AngⅡ，共同孵育24 h。上述各组细胞均置于5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养。

1.5培养细胞的活性鉴定 无菌条件下将细胞悬液按200 μl/孔接种于96孔培养板内。5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，吸去培养液。根据上述不同的实验设计分组加药，设不加细胞不加药组为调零孔。培养一定时间后，采用MTT法检测细胞活性。实验至少重复3次。

1.6流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率 (1)将传代后HUVEC接种在培养瓶中，培养24 h;(2)换用DMEM高糖培养液(无血清)作用24 h，使细胞同步化;(3)按1.2.2实验细胞分组及预处理后，继续培养48 h;(4)0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化培养瓶中细胞，用冷的PBS洗涤细胞两次;(5)加入400 μl的1×Binding buffer悬浮细胞，调整细胞浓度为1×106个细胞/ml;(6)在细胞悬液中加入5 μl Annexin VFITC轻轻混匀，2℃ ～8℃避光孵育15 min;(7)加入10 μl的PI后轻轻混匀，2℃ ～8℃避光孵育5 min;(8)1 h内流式细胞仪检测和分析细胞凋亡率。每组实验重复3次。

1.7Western蛋白免疫印迹法检测Bax、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白表达 (1)取空白对照组、AngⅡ组和AngⅡ+蓝莓花色苷组细胞各一瓶，按各组实验设计给药24 h后，用PBS(最好是冷的)洗3遍，吸干，加300 μl RIPA裂解液于冰上或冰盒上反应5 min，用细胞刮刮培养瓶，用移液器分别收集到洁净的EP管里，于管壁做好标记，置于已预冷至4℃离心机中反应30 min，3 000 r/min离心15 min，分别转移上清液至新的EP管中，做好标记后13 000 r/min，离心10 min;(2)加入4×loading buffer，调蛋白浓度至 0.8 μg/μl，混匀后，加入巯基乙醇(1 ml裂解液中加入60 μl巯基乙醇);(3)用封口膜封好EP管，95℃以上煮沸10 min、90℃左右微沸5 min，冷却后可放于－20℃冰箱保存备用。(4)蛋白浓度的测定严格按照二喹啉甲酸(BCA)试剂盒说明书操作。结果以目的蛋白与GAPDH的OD比值表示。

1.8统计学方法 应用SPSS13.0软件行t检验。

2结果

2.1AngⅡ对HUVEC增殖的抑制作用 HUVEC用不同浓度的 AngⅡ(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)给药 24 h 作用后，各浓度AngⅡ对HUVEC的增殖都有抑制作用，有一定的浓度依赖性，浓度≥10-6mol/L时对HUVEC的增殖抑制作用更加显著，AngⅡ10-4mol/L时细胞增殖被抑制了44%;给药48 h后，AngⅡ诱导组各浓度对HUVEC的增殖都有抑制作用，有明显的剂量依赖性，与空白对照组比较，AngⅡ10-4mol/L时细胞的增殖被抑制了50%。因此，选取10-6mol/L作为AngⅡ最适实验浓度。见表1。

2.2蓝莓花色苷对HUVEC增殖的影响 见表2。给药24 h后，低浓度蓝莓花色苷可轻度增加HUVEC的增殖作用，呈浓度依赖性，当浓度≥40 μg/ml时对HUVEC的增殖出现抑制作用，也有一定的浓度依赖性，最高浓度使细胞增殖抑制了11%;给药48 h后，蓝莓花色苷浓度≥40 μg/ml时对HUVEC的增殖亦有抑制作用，与空白对照组比较，最高浓度时细胞的增殖被抑制了11%。因此，本实验选取20 μg/ml作为蓝莓花色苷的最适实验浓度。

表1AngⅡ对HUVEC增殖的抑制作用(x ± s，n=7)

表2 蓝莓花色苷对HUVEC增殖的影响(x ± s，n=7)

2.3蓝莓花色苷对Bax、Caspase-3的影响 蓝莓花色苷能够降低Bax的表达，抑制Caspase-3的激活。见图1。

图1 蓝莓花色苷对Bax、Caspase-3的影响

3讨论

随着对血管内皮细胞(VEC)生物功能的不断认识探究，认为AS早期形成的始动环节是内皮细胞功能的阻碍〔4〕。VEC损伤参与粥样斑块的形成，同时可诱发血管收缩及形成血栓，因此，VEC的损伤和凋亡被认为是AS的触发环节和早期最重要病变特征〔5〕。研究表明，AngⅡ可以通过增加血管内膜的通透性，激活核转录因子(NF)-κB，增加黏附分子、炎症趋化因子以及细胞因子的表达，引起LDL的摄取和氧化，并诱导产生活性氧(ROS)，直接灭活NO，氧化低密度脂蛋白(LDL)，导致氧化应激等促进内皮细胞凋亡。本研究证明蓝莓花色苷对细胞凋亡具有抑制作用;蓝莓花色苷有抗氧化、保护VEC的功能，在AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡中，氧化应激起着重要作用。综上所述，本研究表明蓝莓花色苷对HUVEC凋亡的抑制作用无论是细胞存活率方面，还是凋亡蛋白表达量方面都具有显著变化，影响Bax、Caspase-3的表达、降低胞内ROS也是其抗凋亡机制之一，从而影响ROS-NF-κB-Caspase-3通路，发挥抑制细胞凋亡的作用。提示蓝莓花色苷可能是重要的抗氧化药物。

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2 Abidov M，Jimenez Del Rio M，Ramazanov A，et al.Efficiency of pharmacologically-active antioxidant phytomedicine Radical Fruits in treatment hypercholesteremia at men〔J〕.Georgian Med News，2006;140:78-83.

3 de Pascual-Teresa S，Moreno DA，García-Viguera C.Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health:a review of current evidence〔J〕.Int J Mol Sci，2010;11(4):1679-703.

4 孟娟娟.血管内皮细胞功能与动脉粥样硬化的研究进展〔J〕.价值工程，2014;33(15):295-6.

5 Luscher TF.Vascular protection:current possibilities and future perspectives〔J〕.Int J Clin Pract，2001;117(Suppl):3-6.