高脂血症对脑缺血大鼠血清超氧化物歧化酶、丙二醛和脑组织细胞间黏附分子 -1、新生血管的影响

张振强 吕欢欢 贾亚泉 宋军营 李澎涛 潘彦舒 吕 靖

(河南中医学院，河南 郑州 450008)

缺血性脑血管疾病目前已经成为严重危害人类健康三大疾病之一。而单纯性脑缺血在临床上发病率较低，多数是在高脂血症、高血压、糖尿病等高危因素条件下发生的，在基础病变条件的影响下，缺血性脑病的病理生理过程虽然也伴随有脑水肿、自由基损伤、炎症反应、血液高凝状态、神经细胞坏死及凋亡等共同特征，但是也有一定的差异，如内皮细胞和神经功能损伤的程度、炎症因子表达、神经细胞凋亡的方式等并不是完全相同的。本文从单纯脑缺血和高脂血症合并脑缺血在超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、细胞间黏附分子(ICAM)-1和血管新生等方面进行对比，探讨高脂血症对缺血脑组织在不同时期相关因素的影响。

1 材料和方法

1.1动物与分组 健康 Wistar大鼠，雄性，SPF级，280～300 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为:SCXK(京)2007-0001，质量合格证号:0243109。适应性饲养1 w后，将其随机分为正常对照组、高脂血症组、正常假手术组、高脂血症假手术组、单纯脑缺血组(正常动物复制脑缺血模型)、复合脑缺血组(在高脂血症基础上复制脑缺血模型)。其中单纯脑缺血组和复合脑缺血组设两个时间组，分别为复制脑缺血模型手术后3 d和7 d，每组手术成功后10只。

1.2仪器与试剂 FA/JA-B型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，YP1201N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，MK3型酶标仪(Thermo)，WELLWASH4MK2型洗板机(Thermo)，TDZ5-WS型自动平衡离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)。水合氯醛(北京化学试剂公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)(迈新公司)、EDTA缓冲液(迈新公司)、DAB显色工作液(迈新公司)，SOD(美国 R＆D Systems公司)、MDA(美国R＆D Systems公司)，兔抗大鼠 ICAM-1抗体(武汉博士德公司)、聚合HRP标记抗兔 IgG(武汉博士德公司)、兔抗大鼠CD34抗体(武汉博士德公司)。

1.3实验动物模型制备

1.3.1高脂血症大鼠模型制备 正常对照组、正常假手术组、单纯脑缺血组给予正常饲料饲养;高脂血症组、高脂血症假手术组、复合脑缺血组用加工的高脂高糖饲料〔1〕(组成:80.8%基础饲料、10%猪油、5% 白糖、3.5%胆固醇、0.5% 胆酸钠、0.2% 丙硫氧嘧啶)饲养，饲养4 w后断尾取血检测大鼠血脂值，以高脂饲料饲养组血脂检测结果与正常饲料饲养组相比较具有显著的区别，说明高脂血症模型复制成功，否则继续以高脂饲料饲养。

1.3.2大脑中动脉缺血模型制备 在高脂血症模型复制成功后，于手术前禁食8 h，不禁水。根据Longa等〔2〕报道的利用线栓法建立局灶性大鼠中动脉栓塞脑缺血模型，具体操作方法如下:①10%水合氯醛溶液(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉后背位固定;②备皮，颈中切口，分离出左侧的颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉三动脉，分别用无损动脉夹夹闭左侧颈总动脉和颈内动脉;③用眼科剪在颈外动脉远端剪一楔形小口，由此插入线栓(直径约0.25 mm，头端加热呈直径约0.3 mm的圆球形)使之由颈外动脉通过分叉部进入颈内动脉到大脑中动脉的起点，插入线栓长度约18～22 mm，使大脑中动脉的血液供应阻断;④适量青霉素对手术切口处消炎后缝合。正常假手术组和高脂血症假手术组只结扎游离颈外动脉。⑤术后，保持动物体温，在苏醒后进行行为功能的观察与评分，根据评分结果进行下一步实验。

1.4行为功能的观察与评分 大鼠手术苏醒后和取组织前分别进行行为功能评分。评分的判定标准依照Longa的5级评分方法进行评分:0分:无体征，大鼠自由活动;1分:动物左侧前肢不能完全伸展;2分:左前肢瘫痪，出现右旋追尾现象;3分:肢体瘫痪，不能站立;4分:动物昏迷，无自主性活动。其中评分结果为1～3分的动物可入组进一步实验。

1.5酶联免疫方法(ELISA)检测血清中SOD和MDA的含量模型制备成功后在相应时间点，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉后背位固定，打开腹腔，从腹主动取血5 ml，置于10 ml普通采血管内静置30 min，在全自动平衡离心机上，3 000 r/min，离心15 min，取上清液1～3 ml依照 ELISA试剂盒检测方法进行检测。

1.6免疫组化法检测高脂血症合并脑缺血大鼠脑组织中ICAM-1和CD34的表达 模型制备成功后在相应时间点，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，背位固定，先行心脏灌注后，断头取出全脑。脑组织经过常规脱水，蜡封，3%H2O237℃孵育10 min，阻断灭活内源性过氧化物酶0.01 mmol/L枸橼酸缓冲液微波修复抗原12 min，室温冷却20 min以上;用正常羊血清工作液封闭，37℃20 min，除去多余封闭液，勿洗。兔多克隆抗体 ICAM-1(1∶200)和 CD34(1∶200)4℃冰箱孵育过夜，PBS 冲洗3次，每次5 min(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照);生物素标记二抗，37℃孵育60 min，HRP标记链亲和素孵育60 min，DAB显色液反应染色。苏木精染核，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。置于40倍物镜下拍照。实验结果采用Image-proplus 6.0图像分析系统计算平均光密度值。

1.7统计学方法 采用 SPSS16.0统计软件行单因素方差分析和t检验。

2结果

2.1高脂血症合并脑缺血大鼠血清MDA及SOD活性测定见表1。MDA的表达变化是:在单纯脑缺血组和正常假手术组组内比较，手术后3 d时的表达升高，(P＜0.05);而手术后7 d时的表达下降;在复合脑缺血组与高脂血症假手术组组内的比较，手术后3、7 d时的表达均呈下降趋势，且两组差异显著(P＜0.05);而复合脑缺血组与单纯脑缺血组组间比较，手术后3 d、7 d时表达均下降(P＜0.05)。SOD在各个脑缺血模型组随缺血时间的延长均表现为活性降低，复合脑缺血组与高脂血症假手术组和单纯脑缺血组与正常假手术组的组内比较，其数据间的差异均显著(P＜0.05);但复合脑缺血组与单纯脑缺血组组间进行比较，其实验结果无明显差异(P＞0.05)，但SOD与MDA的比值增大，通过比值结果时行比较其差异显著(P＜0.05)。

表1 高脂血症合并脑缺血大鼠血清MDA和SOD水平及组织ICAM-1、CD34表达比较(x ± s，n=5)

2.2高脂血症合并脑缺血组织中ICAM-1和CD34的表达ICAM-1和CD34在脑缺血模型的各个时间点均为高表达，复合脑缺血组与高脂血症假手术组和单纯脑缺血组与正常假手术组的组内比较，其组间的差异均显著(P＜0.05);并且复合脑缺血组与单纯脑缺血组组内比较，表达增高，3、7 d组间差异显著(P ＜0.05)。见表1 和图1，图2。

图1 高脂血症病理条件下脑缺血组织中ICAM-1的表达(DAB，×400)

图2 高脂血症病理条件下脑缺血组织中CD34的表达(DAB，×400)

3讨论

缺血性脑血管多为脑血管痉挛或栓塞引起脑组织缺血缺氧而致能量耗竭、兴奋性氨基酸释放、细胞内钙超载、自由基的产生等，导致脑组织水肿、神经细胞变性坏死，脑细胞的各种生物酶活性丧失或转化为对脑细胞有损害的酶，线粒体破坏，功能丧失，溶酶体膜裂解，大量溶媒溢入细胞质，促使脑细胞发生自溶。由此可见，自由基介导的自由基连锁反应是脑缺血后继发性损伤的重要环节之一〔3〕。

研究表明〔4〕，在人和动物的模型实验研究中，在由缺血引起的脑卒中与活性氧的增加有关。SOD是体内特异性清除过氧阴离子(O-2)的抗氧化酶，在生理状态下，SOD可以及时地清除机体代谢产生的氧自由基，使细胞得到保护而免受损伤，因此，机体清除氧自由基的能力与SOD活性的高低有关〔5〕。作为抗氧化应激组成成分的SOD，SOD活性在脑缺血中的异常表达使脑部的紊乱进一步加剧〔6，7〕。SOD活性的表达增加，主要是通过抑制JNK(丝裂原激活蛋白激酶家族成员)信号通路，从而降低激活蛋白-1(AP-1)和核因子-κB(NF-κB)的活性而产生相应的抗氧化作用〔8，9〕。脑缺血后产生的自由基通过攻击脂质膜中的不饱和脂肪酸，使之发生脂质过氧化反应，产生MDA，导致脂膜损伤，通透性增加，各种细胞器解体，生物膜严重损伤〔10〕。MDA是作为脂质过氧化的终产物，其含量多少直接反映自由基损伤程度〔11〕。最近研究表明MDA作为氧化应激状态下脂质过氧化物的显著性标记反映机体氧化应激水平。本研究结果显示:在高脂血症条件下MDA活性表达增高，SOD活性表达降低。在复合脑缺血状态下，MDA活性相比高脂血症条件下进一步增高，SOD活性表达降低;但在脑缺血7 d时，复合脑缺血组与单纯脑缺血组相比较，SOD活性和MDA活性的比值增大，这提示在高脂血症条件下，脑缺血随缺血时间的延长在7 d时的抗自由基损伤的能力呈增强的趋势。

ICAM-1是一种分子量为80～110 kD的细胞膜表面糖蛋白分子，其存在于细胞表面、介导细胞与细胞之间或细胞与基质之间，其作为炎性反应标志物在脑缺血发生后的炎症反应中起到始动作用。正常情况下，ICAM-1在血管内皮细胞上呈低表达，脑缺血时，ICAM-1在血管内皮细胞上明显上调〔12〕。ICAM-1的过度表达可促进白细胞与内皮细胞的黏附、迁移和浸润，并释放蛋白酶及毒性氧化物，最终放大炎症反应效应，加重神经元坏死〔13〕。CD34是一种跨膜糖蛋白，在人和鼠血管内皮祖细胞、造血干细胞及其他组织中能够表达，有黏附、调控造血细胞增殖和分化以及促血管前内皮细胞聚集并形成血管等功能〔14〕。CD34在炎症、缺氧等因素作用下，通过结缔组织、内皮细胞、炎症细胞等产生能够促使血管内皮细胞生长的转化生长因子(TGF)-1、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源生长因子(PDGF)等多种活性物质，在毛细血管和细静脉的基础上诱导新生血管的形成，在脑缺血过程中起保护作用。通过前期研究表明:高脂血症模型大鼠脑组织 ICAM-1和CD34表达均增多〔15〕。本研究结果显示ICAM-1、CD34表达增高，且复合脑缺血组在缺血3、7 d均高于单纯脑缺血组，差异显著，这些结果表明复合脑缺血组新生血管增加明显。高脂血症和脑缺血均可诱发上述因子高表达，出现累积现象，但是否会产生累积效应而引起损伤加重，结合前期研究:在高脂血症条件下，脑缺血大鼠在缺血不同时期血管调节因子表现出累积与特异性的表达的现象，可能在脑缺血恢复期有助于损伤的修复〔16〕;基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的增加，可能对脑缺血后神经元有修复和保护作用〔17〕。根据以上研究推测，3 d主要引起炎症损伤，7 d参与损伤修复过程，但其确切机制尚需进一步的研究验证。

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