Ccbel病毒对喉癌Hep—2细胞ⅦGF—C表达的影响

李文媛++刘艳翠++尹国华++冯克俭++王莹

[摘要]目的探讨胶质和钙结合EGF区域l（Collagen and calcium binding EGF domains 1，Ccbel）病毒对人喉癌细胞系Hep-2细胞增殖及血管内皮生长因子-C（vessel endothelium growth factor C，VEGF-C）表达的影响。方法用lxl02，lxl04，lxl0⁶pfu/mL的Ccbel腺病毒作用喉癌Hep-2细胞，细胞分为对照组（PBS），Ccbel病毒高、中、低剂量组。观察各组细胞增殖情况，采用PCR检测各组细胞VEGF-C mRNA的表达水平。结果与对照组比较，Ccbel病毒各剂量组细胞增殖显著增高，VEGF-CmRNA表达水平显著上升，且均有显著剂量依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。结论Ccbel病毒可能通过上调淋巴管生成因子VEGF-C表达促进喉癌细胞增殖和淋巴管生成。

[关键词]Ccbel病毒；VEGF-C：喉癌；Hep-2细胞

[中图分类号]R739.65

[文献标识码]A

[文章编号]1674-0742（2015）07（c）-0010-03

喉癌是我国东北地区最为常见的耳鼻咽喉科恶性肿瘤。发病率高，危害大。近年来，随着分子生物学和细胞学的发展，一系列关于喉癌发病与治疗的相关机制得到探讨。目前发现多种淋巴管生成因子参与喉癌的生长与淋巴管转移，有研究表明Ccbel（胶原和钙结合蛋白表皮生长因子-域-1）作为新发现的一种淋巴管生成因子，在斑马鱼胚胎期进行Ccbel基因沉默后，其淋巴管和血管完全丧失。但关于Ccbel对肿瘤细胞的影响尚不清楚。该实验在2014年3月-2014年6月期间通过观察Ccbel病毒对喉癌Hep-2细胞增殖及VEGF-C的表达的影响，探讨Ccbel对肿瘤细胞淋巴管生成的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

实验时间：2014年3月-2014年6月。胎牛血清（美国Hy-clon公司），CCK-8法（美国Sigma公司），PCR试剂盒（Invitrogen公司）；引物设计（大连宝生物公司）。

1.2 细胞株培养和病毒干预分组

人喉癌细胞株Hep-2（中国科学院上海细胞生物研究所），依据参考文献进行培养，RPMI1640培养液（含10%胎牛血清），至对数期进行实验，制成单细胞悬液（4xl0⁵/mL）。Ccbel病毒（Ccbel Adenovirus Mouse，购于美国abm公司，No.80829A），实验分为空白对照组（PBS），Ccbel低剂量组（lxl0² pfu/mL），Ccbel中剂量组（lxl0⁴pfu/mL），Ccbel高剂量组（lxl0⁶pfu/mL）。

1.3 CCK-8法检测

取各组单细胞悬液种植于96孔培养板（每孔100μL），培养48h后加入10μL的CCK-8溶液（sigma公司），常规CCK-8法检测，酶联免疫检测仪上检测每孔的吸光度值（OD490）。

1.4 实时荧光定量PCR检测

总RNA提取，采用Pollmann等嗍报道方法进行PCR反转录、检测及荧光定量分析。VEGF-C以及β-actin的引物的序列为：VEGF-C，上游5'-CTACAGATGTGGGGGTTGCT-3'，下游5'-CATCCAGCTCCUGTTTGGT-3'；NF-KB，上游5'-GAAGAAGC-GAGACCTGGA-3'，下游5'-TCCGGAACACAATGGCCA-3'；β-actin，上游5'-TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC-3'，下游5'-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3'，分析方法利用2-AA cr方法。

1.5 统计方法

所得数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料连续型变量采用（X±S）表示，多组间均数比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ccbel对Hep-2细胞增殖的影响

培养ld后，与对照组相比，Ccbel各干预组能够显著促进Hep-2细胞生长，中剂量组和高剂量增殖高于低剂量组，差异有统计学意义（P<0.05），培养3 d和Sd后，Ccbel各干预组增殖增高，差异有统计学意义（P<0.01），其中Ccbel高剂量组较中剂量组和低剂量组增殖更为显著，差异有统计学意义（P<0.05）。其促进作用呈浓度依赖性（见表1）。

2.2 各组细胞VEGF-C mRNA相对表达水平比较

与对照组比较，Ccbel病毒低、中、高剂量组VEGF-C mRNA相对表达水平显著增高，差异有统计学意义（P<0.05），其中Ccbel病毒高剂量组VEGF-C mRNA相对表达水平显著高于Ccbel病毒低、中剂量组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

3 讨论

喉癌是耳鼻咽喉科最常见的恶性肿瘤，在我国东北地区发病率逐年上升，其中近95%患者为鳞状上皮癌，其细胞系为hep-2细胞，尽管近年来相关治疗如激光切除术和化学药物治疗已取得了较大进展，但淋巴管转移和复发率仍高达20%，因此，开发新的有效治疗喉癌淋巴管转移的方法已尤为迫切。

以往研究已经证实喉癌中VEGF-C表达上调，但对于VEGF-C在喉癌细胞系方面的研究仍存在争议翻。VEGF-C能够选择性增强淋巴管内皮细胞有丝分裂；刺激内皮细胞增生并促进淋巴管生成；参与淋巴管外基质重塑。到目前为止已有大量的研究证明在胚胎发育、组织再生和肿瘤的生长过程VEGF-C在淋巴管新生过程中有极其重要的作用。最近发现的分泌蛋白Ccbel是淋巴管生成不可或缺的重要生成因子。研究发现在斑马鱼、小鼠和人类.Ccbel基因突变导致淋巴管增生和淋巴水肿（Hennekam综合征），Ccbel促进淋巴管新生并且可能参与肿瘤细胞的增殖。此外，发现胚胎期在一些组织Ccbel和其他的淋巴管生成因子表达下降，并证实Ccbel能够独立调节淋巴管生成。但Le等发现Ccbel在卵巢癌细胞株中显著下调，与卵巢癌的发生和发展呈负相关。前期研究证实喉癌中Ccbel表达显著增高，参与喉癌淋巴管生成和血管生成，该研究从体外实验探讨Ccbel的作用机制。

Jeltsch表明Ccbel是VEGF-C活化的必要条件，VEGF-C信号通路可能是Ccbel作用的重要下游信号通路。该研究CCK-8法结果表明，Ccbel各干预组能够显著促进Hep-2细胞生长，其中3d和5d.Ccbel高剂量组较中剂量组和低剂量组增殖更为显著，显示Ccbel干预组能够显著促进喉癌hep-2细胞增殖，并具有浓度依赖性，证实了Ccbel能够促进Hep-2细胞增殖能力，这与Pollmann等的研究结果相一致。但Ccbel的作用机制目前尚不明确，该研究发现与对照组比较.Ccbel病毒各剂量组VEGF-C mRNA表达水平均显著上升，其中Ccbel病毒高剂量组VEGF-C mRNA相对表达水平显著高于Ccbel病毒低、中剂量组，高于对照组4～5倍，VEGF-C是重要的淋巴管生成因子，因此我们推测Cebel可能通过上调VEGF-C信号通路发挥作用。

综上所述，该研究证实了Ccbel能够上调喉癌hep-2细胞中VEGF-C表达，提示Ccbel可能通过活化VEGF-C.促进喉癌细胞增殖和淋巴管转移。