上皮源性卵巢癌中4种miRNAs的表达及其临床意义

2015-11-18刘佳宇赵妍蕊张丽娜闫晔郑红

天津医药 2015年9期

刘佳宇，赵妍蕊，张丽娜，3，闫晔，郑红△

临床研究

刘佳宇1，2，赵妍蕊1，张丽娜1，3，闫晔4，郑红1△

目的分析上皮源性卵巢癌（EOC）组织中miR-200a、miR-141、miR-205和miR-34a的表达及其临床意义。方法44例EOC患者按FIGO分期分为FIGOⅠ～Ⅱ（FIGO早期组）组15例和FIGOⅢ～Ⅳ（FIGO晚期组）组29例，用实时荧光定量PCR定量比较2组4种miRNAs的表达差异并考察4种miRNAs表达间的关联。以各组miRNAs表达的中位数将EOC患者分为miRNA高表达组和低表达组，比较2组患者间的生存差异。按年龄、FIGO分期、术后是否有残余瘤及术后化疗情况分组，进行Kaplan-Meier生存分析和Cox多因素分析。结果FIGO晚期组miR-141的表达高于早期组（P=0.036）。miR-141的表达与miR-200a、miR-205呈正相关，与miR-34a呈负相关（均P＜0.05）；miR-200a与miR-205的表达呈正相关（P＜0.05）。生存分析显示，miR-200a的表达低，卵巢癌患者无进展生存期短（P=0.035），FIGO早期组生存率高于FIGO晚期组（P＜0.05）。miR-200a的表达水平、FIGO分期以及年龄与卵巢癌患者总生存期和无进展生存期有关，miR-141、miR-205和miR-34a的表达水平、术后残余瘤以及化疗与患者生存无关。结论miR-200a的表达与卵巢癌患者预后有关，可能是卵巢癌患者预后预测的独立影响指标。

微RNAs；卵巢肿瘤；上皮-间质转化；上皮源性；miR-200a；miR-141；miR-205；miR-34a

上皮源性卵巢癌（EOC）发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中仅次于子宫癌，但其致死率位居妇科肿瘤之首［1］。卵巢位于盆腔深部，不易扪及，缺乏典型的早期临床症状和有效的诊断方法，发现EOC时已多处于肿瘤晚期并发生了腹腔或远处转移。EOC预后不良者较多，进展期患者的5年生存率甚至不到30%［2］。2010年，EOC位于中国城市女性恶性肿瘤发病率第9位，致死率却是妇科肿瘤第1位［3］。因此，EOC发生发展中进行分子标志物的研究对EOC的防治有重要意义。上皮-间质转化（EMT）是上皮源性肿瘤发生发展过程中的一个重要事件［4］，是一个有序的基因表达调控过程，多种转录因子和转录后调控因子如microRNAs（miRNAs或miRs）参与其中［5］。笔者前期研究显示，有9种miRNAs在EOC患者血浆中表达高于健康对照组，其中包含miR-205、miR-141、miR-200a、miR-34a 4种与EMT相关的miRNAs［6］。本研究旨在探讨这4种miRNAs在EOC组织中的表达情况，并分析其与患者临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2007年2月—2010年7月于天津市肿瘤医院行手术治疗的44例EOS组织样本，患者平均年龄（57.48±11.77）岁。组织学类型：浆液性癌20（45.5%）例、子宫内膜样癌12（37.3%）例、黏液性5（11.4%）例、透明细胞癌3（6.8%）例及其他病理类型上皮源性癌4（9.0%）例。国际妇产科联盟（FIGO）的分期标准：Ⅰ期5例、Ⅱ期10例、Ⅲ期25例、Ⅳ期4例。所有患者术前均未接受过放、化疗，术后均经病理明确诊断。本研究经天津医科大学伦理委员会认可。

1.2 主要仪器与试剂总RNA提取试剂Trizol、miRNAs特异性逆转录引物、逆转录试剂盒、miRNAs特异性TaqMan MGB探针引物及TaqMan PCR Master Mix（No UDG）均购自美国应用生物系统公司。4种miRNAs及其内参照的名称及检测序列信息，见表1。

Tab.1 The sequence and assay ID of 4 miRNAs and RNU6B表1 4种miRNAs及其内参照的序列及特异性引物探针产品编号

1.3 方法（1）提取组织总RNA。取冻存的EOC组织样本50 mg在液氮中研磨至粉末状，加1 mL Trizol并按说明书提取总RNA，NanoDrop 2000c（Thermo公司）微量紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，稀释至50 mg/L，-80℃保存。（2）cDNA合成。依据试剂盒说明书，采用miRNA茎环结构（stem-loop）特异性逆转录引物和miRNA逆转录试剂盒进行，总反应体系为15 μL，逆转录反应条件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min。cDNA样本置于-20℃保存。（3）实时荧光定量PCR。每个PCR反应体系为15 μL，每个样本设3个复孔重复检测，用ABI Prism7900HT荧光定量PCR仪进行TaqMan荧光定量检测。反应条件：95℃变性10 min；95℃15 s，60℃60 s；40个循环。以RNU6B作为内参照，以lg2-△△Ct表示miRNA的相对表达量，Ct值为循环阈值，以内参照RNU6B循环阈值进行标准化，△Ct=（CtmiRNA-CtRNU6B），△△Ct=△Ct-△Ctmean。

1.4 观察指标将44例EOC患者按FIGO分期分为FIGOⅠ～Ⅱ（FIGO早期组）组15例和FIGOⅢ～Ⅳ（FIGO晚期组）组29例，比较2组4种miRNAs的表达差异。对44例EOC患者进行定期随访，截止时间为2012年12月，其中2例失访，随访率95.45%。随访时间5～49个月，中位时间26个月，20例出现复发转移，15例在随访期发生肿瘤相关死亡。以各组miRNAs表达的中位数将EOC患者分为miRNA高表达组和低表达组，比较2组患者间的生存差异。临床资料中按年龄、FIGO分期、术后是否有残余瘤及术后化疗情况进行分组纳入生存分析。无进展生存期（PFS）定义为患者接受治疗，到出现EOC局部区域的复发或远处转移或死亡的时间。总生存期（OS）定义为从确诊患EOC到死亡的时间。

1.5 统计学方法采用Graphpad Prism 5.0和SPSS17.0统计软件包进行分析。符合正态分布的计量资料以表示，2组间均值比较行t检验，不符合正态分布的行秩和检验。相关性采用Pearson相关分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，用log-rank法检验生存率差异。Cox比例风险回归模型对影响PFS及OS的因素进行多因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.14 种miRNAs在EOC组织中的表达情况及其与FIGO分期的关系FIGO晚期组miR-141的表达高于早期组（P＜0.05）；但2组miR-200a、miR-205和miR-34a表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

Tab.2 Expressions of 4 miRNAs in EOC tissue and the relationship between them and FIGO stage表2 4种miRNAs在EOC组织中的表达情况及其与FIGO分期的关系

＊P＜0.05

组别FIGO早期组FIGO晚期组t miR-34a 5.29±0.39 5.26±0.35 0.087 n 15 29 miR-141 6.06±1.17 6.70±0.59 2.092＊miR-200a 5.76±1.14 6.34±0.52 1.622 miR-205 4.92±1.32 5.60±0.84 1.869

2.2 EOC组织中4种miRNAs表达量之间的相关性miR-141与miR-200a和miR-205表达量呈正相关，与miR-34a呈负相关（r分别为0.962、0.590及-0.346，均P＜0.05）；miR-200a与miR-205表达量呈正相关（r=0.619，P＜0.05）；miR-34a的表达量与miR-200a和miR-205的表达量无关（P＞0.05）。

2.34 种miRNAs在EOC组织中的表达以及生存分析结果FIGO早期组生存率高于FIGO晚期组（P＜0.05），见表3。miR-200a表达量与EOC预后相关，miR-200a低表达患者PFS更短（P=0.035），与患者OS无明显关系（P＞0.05）；miR-141、miR-205及miR-34a与患者PFS和OS均无关（P＞0.05），见图1、表3。

2.4 miR-200a及临床指标与患者预后的Cox回归分析以年龄（岁，＜55=0，≥55=1），FIGO分期（Ⅰ～Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳ=1），减瘤术残余瘤直径（cm，≤2=0，＞2=1），化疗（是=0，否=1），4种miRNAs（低表达=0，高表达=1）为自变量，患者PFS或OS为因变量，应用Cox比例风险回归显示，年龄、FIGO分期和miR-200a是EOC患者PFS和OS的独立影响因素，见表4。

Tab.3 Univariate analysis of prognosis factors in 44 patients with EOS表3 44例EOC患者生存资料的单因素分析

Fig.1 Survival curves of expressions of 4 miRNAs and the relationship between them and prognosis in patients with EOS图1 4种miRNAs表达水平与EOC患者预后关系的生存曲线

3 讨论

miRNAs是一类长约22个单位的核苷酸，通过特异性地与靶基因mRNA的3′端非翻译区（3′-UTR）互补结合，从而降解或抑制mRNA翻译，进而调控靶基因［7］。研究表明，miRNAs可以通过调控EMT相关的转录因子或通路基因从而参与EMT过程［8］。本研究所涉及到的4种miRNAs参与了已经证实的与EMT密切相关的ZEBs/miR-200、miR-205和SNAIL1/miR-34反馈回路［5，8］。

miR-200a和miR-141同属于miR-200家族并有着相同的“种子区”序列，故调控功能相似——通过转录后调控机制抑制ZEB1/ZEB2的表达，增加E-cadherin的表达，从而抑制EMT［9］。本研究结果显示，FIGO晚期组miR-141的表达高于早期组。虽然miR-200a在FIGO早期组和晚期组中的表达差异无统计学意义，但其表达量晚期组高于早期组，且miR-141与miR-200a的表达呈正相关。miR-200a位于1号染色体，而miR-141位于12号染色体［9］，故二者表达的相关性不是因为位置相近或有着共同的前体而共表达，而可能是受到同样的上游调控机制。本研究生存分析结果显示，miR-200a表达低EOC患者预后差，考虑原因为：一方面可能因为miR-200家族在EOC发展过程中表现出复杂的时相性，即EOC早期，miR-200低表达有助于细胞获得侵袭性，但已经转移了的细胞需要重新获得上皮表型，有助于肿瘤细胞克隆形成和生长，此时miR-200家族可能重新表达增高［10］；另一方面EOC的不同发展阶段miR-200家族的功能不是完全一致，miR-141和miR-200a在未治疗的情况下可以抑制p38α，从而增加肿瘤细胞活力，促进细胞增殖，而癌组织的氧化应激状态诱导miR-200a和miR-141高表达，miR-200a和miR-141高表达又能增加患者对紫杉醇的敏感性，抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡［11］。在EOC组织中高表达的miR-200a可能通过增加化疗敏感性和抑制EMT等多种调控方式提示患者预后良好。

Tab.4 Multivariate analysis of prognosis factors in 44 patients with EOS表4 44例EOS患者生存资料的多因素分析

miR-205是一个功能上与miR-200家族相似，表达与miR-200家族相关的miRNA，同样也可通过抑制ZEB1表达扮演一个EMT的负性抑制因子［12］。本研究显示，miR-205表达与miR-200a和miR-141呈正相关；生存分析显示，随着EOC的进展，miR-205表达升高的趋势，但差异无统计学意义，表明其可能与患者预后无关。不同于在多数肿瘤中低表达，高表达的miR-205在EOC中可能存在另一种调控机制，miR-205能够通过作用于ESRRG、Ez⁃rin和Lamin A/C等靶基因，从而促进细胞增殖和侵袭迁移［13-14］。笔者认为，这可能进一步证实了miR⁃NAs的表达存在组织特异性和功能多样性。

miR-34a是miR-34家族成员之一，而此家族与肿瘤抑制蛋白P53有着正反馈调节关系［15］，在EOC以及大多数肿瘤中充当着抑癌基因的角色［16-17］。Siemens等［18］研究显示，miR-34a可以通过下调SNAIL而抑制TGF-β诱导的EMT，从而逆转EMT过程。本研究结果未显示miR-34a与EOC患者FIGO分期和预后有关。

综上所述，miR-141在EOC晚期患者中表达升高，miR-200a低表达提示患者预后差，是EOC的独立预后指标，有望成为指导临床预后的评估指标。

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（2015-04-28收稿2015-05-07修回）

（本文编辑陆荣展）

Expression and clinical significance of four miRNAs in epithelial ovarian cancer

LIU Jiayu1，2，ZHAO Yanrui1，ZHANG Lina1，3，YAN Ye4，ZHENG Hong1△
1 Department of Epidemiology and Biostatistics，Tianjin Medical University Cancer Hospital and Institute，National Clinical Research Center of Cancer，Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China；2 Gradute School，Tianjin Medical University；3 Department of Breast Surgery，Tianjin Medical University Cancer Hospital and Institute；4 Department of Gynecology and Obstetrics，Tianjin Medical University General Hospital△

ObjectiveTo determine the expressions of miR-200a，miR-141，miR-205 and miR-34a in epithelial ovarian cancer（EOC）samples and to explore their clinical significance.MethodsAccording to FIGO staging，44 EOC pa⁃tients were divided into two groups：early FIGO stage（stageⅠ-Ⅱ，n=15）and late FIGO stage（stageⅢ-Ⅳ，n=29）.Expres⁃sions of 4 miRNAs were detected by real time quantitative PCR，and were compared between two groups.The correlation of 4 miRNAs was calculated.EOC patients were divided into high miRNA expression group and low expression group according to the median value of miRNAs expression.Kaplan-Meier survival analysis and Cox multivariate analysis were used to com⁃pare the age，FIGO state，tumor residual after operation and post-operative chemotherapy of ovarian cancer between two groups.ResultsThe expression of miR-141 was elevated in stagesⅢandⅣcompared with that of stagesⅠandⅡ（P= 0.036）.There was a positive correlation between expression of miR-141，miR-200a and miR-205，but a negative correlation with miR-34a（P＜0.05）.There was a positive correlation between miR-200a and miR-205（P＜0.05）.Lower miR-200a ex⁃pression was associated with shorter progress free survival in ovarian cancer analyzed by log-rank test（P=0.035）.The sur⁃vival rate was significantly higher in FIGO stagesⅠandⅡthan that of FIGO stagesⅢandⅣ（P＜0.05）.Cox regression analysis revealed that miR-200a，FIGO stage and age were influential factors of overall survival time and progress-free sur⁃vival time of ovarian cancer，while miR-141，miR-205，miR-34a and tumor residual after operation and post-operative che⁃motherapy were not influential factors.ConclusionThe expression of miR-200a is closely correlated with the progress and prognosis of ovarian cancer and may be used as an independent indicator for ovarian cancer prognosis.

microRNAs；ovarian neoplasms；epithelial-mesenchymal transition；epithelial；miR-200a；miR-141；miR-205；miR-34a

R737.31；R34-33

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.0010

国家自然科学基金资助项目（81072363）

1天津医科大学肿瘤医院，肿瘤研究所肿瘤分子流行病与生物统计研究室，国家肿瘤临床研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室（邮编300060）；2天津医科大学研究生院；3天津医科大学肿瘤医院乳腺外科；4天津医科大学总医院妇产科

刘佳宇（1989），女，硕士在读，主要从事肿瘤分子流行病学研究

△通讯作者E-mail：zhengh64@aliyun.com