PDTC对高血压大鼠继发左心室肥厚及心力衰竭的作用

2015-11-18牟鑫煜张寰

天津医药 2015年9期

牟鑫煜，张寰

牟鑫煜，张寰△

目的评价核因子（NF）-κB抑制剂吡咯烷二硫基甲酸盐（PDTC）对高血压-心室肥厚-充血性心力衰竭大鼠心脏NF-κB活性和血清中各炎症递质的抑制作用。方法42只雄性Dahl盐敏感大鼠建立高血压-心肌肥厚-心力衰竭动物模型，按随机数字表法分为A组（正常饲料喂养组）、B组（高盐饲料喂养组）、C组（早期NF-κB抑制组）、D组（高血压期NF-κB抑制组）、E组（心肌肥厚期12周NF-κB抑制组）、F组（心肌肥厚期16周NF-κB抑制组）、G组（心力衰竭期NF-κB抑制组），每组6只。各组分别按特定时间段予以8%高盐饲养及PDTC 100 mg/（kg·d）腹腔内注射，观察不同时长的PDCT给药期对血压、左心室舒张末期室间隔厚度（IVSD）、左室舒张末期后壁厚度（LVPWD）、左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD）、左室射血分数（LVEF）、心肺质量/体质量比值、NF-κB活性、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、C反应蛋白（CRP）的影响。结果早期给予PDTC可抑制NF-κB和促炎症细胞因子水平，大鼠心脏结构改变减轻且心脏功能仅呈轻度降低，给药时间越长，对心脏的保护作用越大，可有效地控制血压，在一定程度上阻断未来可能发生的左室肥厚与左室衰竭。当高血压持续、心肌肥厚形成并伴有心力衰竭的情况下，PDTC用药效果作用有限。结论PDTC对大鼠高血压、心室肥厚及充血性心力衰竭的发生发展具有预防和治疗作用，早期应用对维持大鼠心脏的正常心功能作用更加明显。

高血压；心肌病，肥厚性；心力衰竭；细胞因子类；大鼠；吡咯烷二硫基甲酸盐

长期高血压使心脏在持续的压力负荷作用下发生左心室心肌肥厚，甚至进入心脏失代偿阶段，导致不可逆转的左心室心肌肥厚和继发性扩张，心肌收缩力下降，最终引起心力衰竭。近年来发现，核因子（NF）-κB信号通路在心肌肥厚和心力衰竭的发生发展中有重要作用［1］。NF-κB是心脏炎症信号的主要作用因子，在免疫激活中发挥着中心环节作用，促炎症细胞因子激活对心脏有明显的损伤作用，肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1、IL-6等促炎症细胞因子高表达核内转录因子，进而发挥作用。吡咯烷二硫基甲酸盐（pyrrolidine dithiocrabamate，PDTC）是目前研究最多的NF-κB抑制剂，其抗氧化作用可抑制NF-κB活性，从而解除血管紧张素（Ang）Ⅱ所诱导的心肌细胞反应性肥厚［2］，并能抑制TNF诱导的反应性氧自由基的产生［3］。近来大量的临床与基础研究一致提示PDTC对于心血管疾病的益处是值得肯定的［3］，但具体作用机制、给药时间点和用药疗程尚需进一步深入研究。本研究探讨PDTC对高血压-心室肥厚-充血性心力衰竭大鼠心脏NF-κB活性和血清中各炎症递质的作用，并探索其最佳给药时间。

1 材料与方法

1.1 材料PDTC［100 mg/（kg·d）］、十二烷基硫酸钠（SDS）、丙烯酰胺、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自Sigma公司；NF-κB寡核甘酸、T4 Polynucleotide kinase、Gel Shift Banding 5×Buffer购自Promega公司；Pierce BCA蛋白分析试剂购自Pierce化学公司；［g-32P］ATP（3 000 Ci/mmol）、ECL化学发光试剂盒购自Amersham公司；anti-rabbit HRP-Linked抗体购自Cell Signaling公司；Kaleidoscope Prestained Standards蛋白质Marker购自Bio-Rad公司。NF-κB p65试剂盒购自上海康成生物医疗技术公司，单核细胞趋化蛋白（MCP）-1和C反应蛋白（CRP）试剂盒购自美国Lifekey生物医疗技术公司。实验动物：5周龄SPF级雄性Dahl盐敏感大鼠42只，体质量（250±20）g，购自日本SEAK吉富株式会社，出生后用正常饲料（含盐0.5%）喂养，自由摄水。

1.2 大鼠模型的建立及分组Dah1盐敏感大鼠自5周龄开始用尾套法每日测定尾动脉压收缩压（SBP），收缩压高于120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）被认为有高血压。采用随机数字表法随机分为A～G共7组，每组6只。A组（正常饲料喂养组）：大鼠于出生后即予以正常饲料喂养，不予其他处理。B组（高盐饲料喂养组）：不予其他处理。C组（早期NF-κB抑制组）、D组（高血压期NF-κB抑制组）、E组（心肌肥厚期12周NF-κB抑制组）、F组（心肌肥厚期16周NF-κB抑制组）和G组（心力衰竭期NF-κB抑制组）分别于第6、8、12、16和20周开始PDTC腹腔内注射。B～G组大鼠于6周龄开始给予8%高盐饲养，如不加其他任何干预，大鼠于8周龄（高盐喂养2周）血压开始升高，12周龄血压明显增高并持续，16周龄出现明显左室肥厚，24周龄全部发生心力衰竭。

1.3 指标的检测将大鼠清醒状态下连接尾动脉压袖套测量尾动脉压，连续测量3次，取其平均值。心脏结构和功能测定：实验大鼠满24周龄时，用水合氯醛麻醉后称质量，胸部脱毛，采用GEVivid 7超声心动图仪检查，探头频率11.0 MHz。于胸骨旁左室短轴切面乳头肌水平，采用M型超声记录左心室、室间隔及左室后壁曲线。用磁光盘记录，回放分析和测量舒张末期室间隔厚度（IVSD）、左室舒张末期后壁厚度（LVPWD）、左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD）；采用Teichholz校正公式［左室容量=7.0D3（2.4+D），D为左室内径］计算左室舒张末期容积（LVEDV）、左室收缩末期容积（LVESV），获得左室射血分数（LVEF），LVEF=（LVEDVLVESV）/LVEDV，所有数据取连续3个心动周期的平均值。心脏质量/体质量比值（HW/BW）、肺质量/体质量比值（LW/ BW）：大鼠称体质量后断头处死，迅速取出心脏和肺脏，用预冷的PBS充分冲洗，滤纸吸干，分别称质量。计算HW/BW，评估心肌肥厚；计算LW/BW，评估心力衰竭（肺淤血）。之后取左心室，-70℃保存待用。血清中炎症介质的检测：处死动物前，经右颈总动脉取血2 mL，以10%乙二胺四乙酸二钠抗凝，立即离心（4℃，1 000×g）分离血清，分装后于-70℃保存待测。TNF-α、IL-6的测定采用放射免疫法，试剂盒购自中国人民解放军总医院生命科学院放射免疫研究所。心肌匀浆胞核蛋白NF-κB p65、血清MCP-1的水平采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测，血清CRP的水平采用乳胶增强透射免疫比浊法检测，均按照说明书操作步骤严格执行。

1.4 标本收集及NF-κB活性检测左室心肌组织中加入Buffer A充分匀浆，在冰上放置15～30 min，再加入适量的10%NP-40，混匀1 min，4℃、10 000 r/min离心3 min，上清即为胞浆蛋白。沉淀用Buffer C悬浮混匀，冰上放置1～2 h，不时振动，再于4℃、14 000 r/min离心10 min，上清即为核提取物。采用Bradford法，以BSA作标准测定胞浆和胞核蛋白浓度。胞浆和胞核蛋白提取物于-80℃保存备用；NF-κB活性检测用凝胶迁移率变化分析法（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）进行。NF-κB序列同源双链寡核苷酸探针序列为3′-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5′，5′-AGT TGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′，采用T4寡核苷酸激酶法，用γ-32P-ATP标记探针。核蛋白-DNA探针结合反应体系按照试剂盒说明进行操作，具体为：等量核蛋白提取物（30 μg），35 fmol γ-32P标记的双链NF-κB寡核苷酸，反应总体积为15 μL。室温静置20 min后加入加样缓冲液，经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。干胶后，-80℃放射自显影，显影后采用BioRad公司的phosphor图像分析系统对图像条带灰度进行定量分析。Western blot分析：经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离待测蛋白，并将其转移至硝酸纤维素膜上。用封闭缓冲液（5%脱脂奶粉，0.05%Tween-20 TBS）封闭1 h。然后与相应的特异性抗体孵育，4℃过夜，次日用封闭缓冲液漂洗3次，再与辣根过氧化物酶标记的二抗于室温孵育1 h后，用0.05%Tween-20 TBS漂洗3次，按0.125 mL/cm2膜加上化学发光制剂，静置1～2 min后压X线底片作为显影记录，phosphor图像分析系统进行定量解度扫描分析。

1.5 统计学方法本实验采用SPSS 16.0统计软件包进行分析，计量资料以均数±标准差表示，经方差齐性检验后2组间分析采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠左心室肥厚及左心功能的比较与A组比较，B、D、E、F、G组左心室厚度增加，左心室功能降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与B组比较，C、D、E、F组左心室厚度减小，左心室功能增加，G组的LVEDD减少，LVEF增加，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of left ventricular hypertrophy and left heart function between seven groups of rats表1 各组大鼠左心室肥厚及左心功能的比较（n=6，）

＊P＜0.05；a与A组比较，b与B组比较，P＜0.05；表2同

组别A组B组C组D组E组F组G组F LVESD（mm）3.77±0.20 4.42±0.18a 3.78±0.12b 3.88±0.15ab 3.93±0.06ab 4.08±0.11ab 4.25±0.08a 2.643＊LVEDD（mm）6.35±0.09 7.38±0.35a 6.43±0.20b 6.48±0.17ab 6.67±0.16ab 6.85±0.09ab 7.01±0.05ab 4.354＊LVPWD（mm）1.57±0.09 1.97±0.13a 1.58±0.11b 1.68±0.17ab 1.76±0.14ab 1.81±0.07ab 1.89±0.08a 2.875＊IVSD（mm）1.48±0.08 1.84±0.11a 1.48±0.13b 1.62±0.25ab 1.69±0.08ab 1.75±0.12ab 1.79±0.16a 3.544＊LVEF 0.72±0.01 0.43±0.01a 0.71±0.02b 0.65±0.02ab 0.60±0.01ab 0.56±0.02ab 0.48±0.02ab 4.878＊

2.2 各组大鼠血压、NF-κB活性及炎症因子的比较与A组比较，B、D、E、F、G组SBP、HW/BW、LW/ BW、NF-κBp65、TNF-α、IL-6、MCP-1和CRP均增加，差异有统计学意义（P＜0.05），与B组比较，C、D、E、F组SBP、HW/BW、LW/BW、NF-κBp65、TNF-α、IL-6、MCP-1和CRP均减少，G组的SBP、LW/ BW、TNF-α、IL-6、MCP-1和CRP减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

3 讨论

随着对高血压和心力衰竭的免疫激活机制研究的深入，发现NF-κB信号通路在心肌肥厚和心力衰竭的发生发展中有重要作用［4-7］。研究表明，抑制心肌梗死大鼠NF-κB活性可使梗死面积明显减小，心力衰竭患者和实验动物的NF-κB水平与活性均明显增高，提示心肌肥厚和心力衰竭时炎症反应对病变心脏不利，长期的NF-κB增高和刺激通过上调促炎症因子造成心肌的损伤，而NF-κB的抑制对心脏结构与功能具有正性作用［8-10］。

Tab.2 Comparisonofbloodpressure，NF-κBactivityand inflammatory factors between seven groups of rats表2 各组大鼠血压、NF-κB活性及炎症因子的比较（n=6，）

组别A组B组C组D组E组F组G组F组别A组B组C组D组E组F组G组F SBP（mmHg）114.7±7.4 224.8±11.7a 126.3±1.6b 150.8±8.2ab 169.3±6.5ab 186.3±6.2ab 208.4±12.1ab 3.266＊TNF-α（µg/L）20.62±2.83 68.62±9.35a 33.42±1.10ab 40.12±3.37ab 49.95±4.70ab 56.60±3.68ab 60.23±1.29ab 3.643＊HW/BW（mg/g）4.35±0.79 11.13±1.06a 5.01±0.60b 5.93±0.19ab 7.06±0.35ab 8.33±0.44ab 10.05±1.78a 4.656＊IL-6（µg/L）1.26±0.21 16.02±1.42a 4.26±0.33ab 5.85±0.71ab 8.53±2.03ab 10.43±1.23ab 13.52±2.84ab 5.426＊LW/BW（mg/g）5.10±0.39 13.80±0.47a 5.87±0.21b 6.64±0.67ab 8.35±0.40ab 10.53±0.78ab 12.21±0.73ab 4.753＊MCP-1（ng/L）101.3±21.1 214.2±2.5a 124.5±7.3ab 140.3±6.9ab 164.1±13.8ab 180.6±4.7ab 203.7±9.8ab 4.215＊NF-κB p65（mg/g）2.98±0.46 7.26±0.58a 3.12±0.10ab 4.05±0.86ab 5.43±0.27ab 6.18±0.12ab 6.97±0.33a 3.452＊CRP（µg/L）4.23±0.07 8.84±0.48a 5.00±0.36b 5.85±0.14ab 6.64±0.25ab 7.57±0.64ab 8.32±0.33ab 4.421＊

PDTC是目前研究最多的NF-κB抑制剂，其抗氧化作用可抑制NF-κB活性，从而解除AngⅡ所诱导的心肌细胞反应性肥厚［11］，并能抑制TNF诱导的反应性氧自由基的产生［12］。一系列研究发现PDTC可使心血管疾病明显获益［11-12］。

本研究中，Dah1盐敏感大鼠出生后6周开始以8%高盐饲养（B组），24周龄时高血压非常明显、左心室重度肥厚并发心力衰竭；而在6周龄开始以8%高盐饲养的同时就每日给予PDTC抑制NF-κB（C组），24周龄时其收缩压、HW/BW、LW/BW、左心室厚度与左心室功能各项指标低于正常饲料喂养的Dah1盐敏感大鼠（A组），心肌NF-κB活性和血清中的CRP等因子也表现出相同的趋向性。这一结果是本研究最具临床价值的发现，有力提示早期抑制NF-κB和促炎症细胞因子可能有效地预防高血压的发生和发展，并可以预防因心脏压力负荷过重继发的左心室肥厚以及心功能不全。在Dah1盐敏感大鼠于用8%高盐饲料喂养2周（8周龄）时开始给予PDTC抑制NF-κB免疫系统和炎性因子（D组），24周龄时（用药16周）其血压绝对水平虽偏高，但尚能控制在相对较低的水平，心功能可以维持在略低于正常的范围，心室肥厚程度相对较轻。这个现象提示如果错过预防性给药的时机，尽早给予PDCT依然能比较有效地控制血压，在一定程度上阻断未来可能发生的左室肥厚与左室衰竭。对12周龄给药（用药12周，E组）、16周龄给药（用药8周，F组）和20周龄（用药4周，G组）大鼠的检测结果表明，给予PDCT越晚，对NF-κB和有关促炎症因子的抑制效果越差，血压和心脏受到致病因素的作用影响越严重，心脏功能越差。G组在第20周龄时给予PDCT，血压和心功能改善较小。这一结果提示如果错过早期预防阶段，又未尽早给予PDCT抑制NF-κB和有关促炎症因子，在高血压持续、心肌肥厚形成并伴有心力衰竭的情况下，PDTC用药效果作用有限。

本研究表明，心肌中NF-κB活性、血清CRP、MCP-1、TNF-α、IL-6与血压、左心室肥厚程度呈正相关，与左心室功能呈负相关。这一结果提示，高血压时尽早抑制NF-κB和促炎症细胞因子水平，是一种较为有效的预防和治疗方法。

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（2015-03-20收稿2015-06-05修回）

（本文编辑魏杰）

Effects of PDTC on ventricular hypertrophy and congestive heart failure in hypertensive rats

MU Xinyu，ZHANG Huan△
Department of Cardiology，The Fourth Central Hospital of Tianjin，Tianjin 300140，China△

ObjectiveTo evaluate the inhibitory effects of NF-κB inhibitor pyrrolidine dithiocar-bamate（PDTC）on NF-kappa B activity and the serum inflammatory mediators in hypertensive-ventricular hypertrophy-congestive heart fail⁃ure rats.MethodsThe rat model of hypertension-cardiac hypertrophy-heart failure was made from 42 male Dahl salt sen⁃sitive rats.Rats were randomly divided into seven groups including group A（normal diet group），group B（high salt diet group），group C（NF-κB inhibition in early stage），group D（NF-κB inhibition in hypertensive stage），group E（NF-κB inhibi⁃tion in cardiac hypertrophy stage of week 12）and group G（NF-κB inhibition in heart failure stage）.There were six rats for each group.Rats were administrated 8%high salt diet and injected PDTC 100 mg/（kg·d）intraperitoneally according to the prescribed time.Changes of blood pressure，left ventricular end diastolic interventricular septal thickness（IVSD），left ven⁃tricular end diastolic posterior wall thickness（LVPWD），left ventricular end diastolic diameter（LVEDD），systolic left ventric⁃ular end diastolic diameter（LVESD），left ventricular ejection fraction（LVEF），heart，lung weight/body weight ratio，NF-kappa B activity，tumor necrosis factor（TNF）-α，interleukin（IL）-6，monocyte chemotactic protein（MCP）-1 and C-reactive protein（CRP）were observed in different treatment time points of PDCT.ResultsLevels of NF-κB and proinflammatory cy⁃tokines were reduced after early administration of PDTC，and the cardiac function was also decreased.The longer the treat⁃ment time，the greater the protective effect on heart.PDTC can effectively control blood pressure，and block left ventricular hypertrophy and left ventricular failure in a certain extent.The effects of PDTC were limited after persistent hypertension，and myocardial hypertrophy formation accompanied by heart failure.ConclusionPDTC plays a role in prevention and treatment of hypertension，left ventricular hypertrophy and congestive heart failure in model rats.Early application of PDTC could obviously maintain the normal cardiac function in rats with heart disease.

hypertension；cardiomyopathy，hypertrophic；heart failure；cytokines；rats；pyrrolidine dithiocar-bamate

R541.3

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.009

天津市卫生局科技基金资助项目（2013KZ016）

天津市第四中心医院心内科CCU（邮编300140）

牟鑫煜（1979），男，主治医师，主要从事高血压病方面研究

△通讯作者E-mail：huan_cn@126.com