高大山羊草1Sl染色体特异分子标记的建立与应用

刘晓明+张姝倩+宫文英+等

摘要：导入小麦的高大山羊草（Aegilops longissima）1S1染色体可以显著提高小麦加工品质及子粒Fe和Zn元素含量，因此，1Sl染色体特异分子标记的建立对子粒Fe和Zn元素含量高的高品质小麦的选育具有重要意义。试验建立了高大山羊草1S1染色体特异分子标记9个，其中染色体短臂标记2个，长臂标记6个，同时定位于长臂和短臂的标记1个。利用建立的分子标记对杂交群体进行检测，结果表明，建立的9个标记可以对分离群体进行有效筛选与鉴定。因此，获得的高大山羊草1Sl染色体特异分子标记可以应用于杂交群体的筛选、鉴定以及辅助选育子粒Fe和Zn元素含量高的高品质小麦。

关键词：高大山羊草（Aegilops longissima）；1Sl染色体；分子标记；小麦育种

中图分类号：Q78；S512.1+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）20-4937-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.003

Construction of 1Sl Chromosome-specific Molecular Markers

in Aegilops longissima and Its Application

LIU Xiao-ming1a，ZHANG Shu-qian1b，GONG Wen-ying2，TANG Hai-tian3，WANG Can-guo2，

CHENG Dun-gong2，LIU Cheng2，LIU Jian-jun2

（1a. Research and Development Center of Biotechnology； 1b. School of Chemistry and Environment，Weifang University of Science and Technology， Weifang 262700， Shandong， China； 2.Crop Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China； 3.Yantai Oceanic Environmental Monitoring Central Station， Yantai 264006，Shandong，China）

Abstract：Since the wheat introduced Aegilops longissima 1Sl chromosome had significantly higher processing quality and higher content of iron and zinc in grain，the construction Aegilops longissima 1Sl-specific molecular markers was necessary and important for selecting and breeding high quality wheat which with high iron and zinc content. In this research，9 molecular markers specific for Aegilops longissima 1Sl were constructed，in which，2 markers located on the short arm，6 markers located on the long arm，and 1 marker located on both short and long arms.The verification experiment showed that the 9 markers were very available in screening and identifying isolated population.It indicated that the constructed 9 Aegilops longissima 1Sl chromosome-specific molecular markers could be used in cross population screening，identification and high quality wheat breeding.

Key words： Aegilops longissima； chromosome 1Sl； molecular marker； wheat breeding

全球有超过30亿的人口处在体内缺Fe和Zn元素的“隐性饥饿”状态下，有超过2.5亿儿童不同程度缺乏Fe和Zn元素[1]。中国小麦子粒矿质元素尤其是Fe和Zn元素含量还不能满足人们的基本需求[2]，因此，需要改良中国小麦矿质元素含量以及选育高品质小麦来改善人们的营养状况。

高大山羊草（Aegilops longissima，2n=14，染色体组为SlSl），是小麦的远缘物种及小麦育种的优异基因源，高抗小麦白粉病、叶锈病和麦二叉蚜、眼斑病，抗干旱胁迫和盐胁迫，对小麦加工品质有显著正效应[3]，能够显著提高小麦子粒Fe和Zn元素含量[4]。目前，抗小麦白粉病基因Pm13被定位在高大山羊草3Sl染色体短臂上，显著提高小麦子粒Fe和Zn元素含量[4]、对小麦加工品质有显著正效应的基因[5]和抗眼斑病主效QTL均定位在1Sl染色体上，因此，高大山羊草1Sl染色体分子标记的建立将对相应杂交群体的筛选与鉴定及辅助选育子粒Fe和Zn含量高的高品质小麦具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

一粒小麦（TA136）、圆锥小麦（TA10543）、高大山羊草（TA1910）、中国春-高大山羊草1S1附加系（TA3573）、中国春-高大山羊草2S1-7S1附加系（TA7544-TA7549）、中国春-高大山羊草1S1短臂（1SlS）和长臂（1SlL）端体附加系（TA7515和TA7516）和中国春1B单体（TA6550）由美国堪萨斯州立大学植物病理系Gill教授提供。中国春（CS）、绵阳11（MY11）和绵阳15（MY15）小麦由电子科技大学生命科学与技术学院杨足君教授提供。Aelon-1-Aelon-101是中国春1B缺体/中国春-高大山羊草1Sl附加系杂交F2群体。

1.2 DNA的提取

DNA的提取参照SDS法[6]。

1.3 引物设计与合成

从国际小麦EST定位工程网（http：//wheat.pw.usda.gov/NSF/data.html）选用120个已经被定位在小麦染色体第一同源群的EST序列为基础设计EST-STS引物120对。第一同源群的EST-SSR引物22对、COS引物30对、PLUG引物42对和SSR引物16对的设计分别参照文献[7-10]。上述引物均由成都瑞信生物公司合成。

1.4 PCR扩增与电泳

EST-STS引物扩增及电泳条件参照文献[11]，EST-SSR引物、COS引物、PLUG引物和SSR引物扩增及电泳条件分别参照文献[7-10]。

2 结果与分析

2.1 筛选高大山羊草1Sl染色体特异DNA片段

以中国春-高大山羊草1Sl附加系与一粒小麦、圆锥小麦、MY11、MY15和CS共5个小麦对照为材料，提取其基因组DNA，用合成的230对引物对这6份材料进行PCR扩增，结果发现分别有6对EST-STS引物（BF200742、BE500714、BE489692、BF604958、BE585781和BG262882）、1对EST-SSR引物（MAG2137）和2对SSR引物（Xgwm135和Xgwm140）可以在中国春-高大山羊草1Sl附加系中扩增出特异DNA片段，而对照一粒小麦、圆锥小麦、MY11、MY15和CS则扩增不出这些片段，说明这些DNA片段均来自高大山羊草。其中，引物BG262882和MAG2137的扩增结果见图1A和图1D。PLUG引物和COS引物则没有在材料中扩增出多态性。

2.2 高大山羊草1Sl单染色体特异片段的验证

为了验证上述获得的特异片段仅分别分布在1Sl染色体上，以中国春-高大山羊草1Sl-7Sl附加系和对照CS为材料，用上述获得的9对引物进行扩增，发现这9对引物仅能在中国春-高大山羊草1Sl附加系中扩增出目标特异片段，而其余6个附加系和CS均未扩增出相应片段，说明这些片段为高大山羊草1Sl染色体特异标记。其中，引物BG262882 和引物MAG2137的扩增结果见图1B和图1E。

2.3 高大山羊草1Sl单染色体臂特异标记的建立

为了进一步将获得的9个第一同源群标记定位在高大山羊草染色体臂上，以中国春-高大山羊草1SlS和1SlL端体附加系为材料，用上述9对引物对其扩增，结果发现这9个标记中，2个被定位在高大山羊草1Sl短臂（1S1S）上，6个被定位在1Sl长臂（1SlL）上，1个标记同时定位在1Sl短臂和长臂上（表1）。其中，引物BG262882 和引物MAG2137的扩增结果见图1C和图1F。

2.4 获得标记对杂交群体的筛选与鉴定

为了验证获得标记的实用性，从中国春1B单体（2n=41）后代中筛选出染色体数目2n=40的1B缺体植株。将中国春-高大山羊草1Sl附加系与1B缺体进行杂交，其杂交F1中因为存在1B和1Sl双单体，不能正常配对，因此，1B和1Sl容易在着丝粒处发生断裂并重接。利用获得的高大山羊草1Sl标记对中国春-高大山羊草1Sl/1B缺体杂交F2的部分分离群体进行筛选。参试的101个单株中，Aelon-1、Aelon-19和Aelon-20等31个植株可以扩增出1S1长臂标记，但是不能扩增出短臂标记（图2），说明这31个植株中只含有1Sl长臂染色体而没有1Sl短臂染色体。Aelon-5、Aelon-7和Aelon-17等35个植株不能扩增出1Sl长臂标记，但是可以扩增出短臂标记（图2），说明这35个植株中不含1Sl长臂染色体而含有1Sl短臂染色体。Aelon-9、Aelon-12和Aelon-52等10个植株不能扩增1Sl长臂标记，也不能扩增出1Sl短臂标记（图2），说明这10个植株中不含有1Sl染色体。Aelon-4、Aelon-6和Aelon-8等25个植株既能扩增1Sl长臂标记，也能扩增出1Sl短臂标记（图2），说明这25个植株中含有1Sl染色体或同时含有1Sl染色体长臂和短臂端体。

3 讨论与结论

本研究发现基于EST序列的COS引物和PLUG引物并没有在供试材料中获得多态性，而EST序列的EST-STS引物和EST-SSR引物分别在供试材料中获得了5.0%（6/120）和4.5%（1/22）的多态性，因此，基于EST序列的不同引物在小麦外缘物种多态性标记建立效率方面也各有不同。基于微卫星序列的SSR引物在供试材料中获得了12.5%（2/16）的多态性，说明在小麦外缘物种多态性标记建立方面，基于基因和非基因水平的序列均应考虑在内。

在高大山羊草染色体标记建立方面，刘旭等[11]建立了高大山羊草基因组RAPD标记5个；Milletet等[12]建立了高大山羊草5Sl染色体的同工酶标记；Neelam等[13]建立了2Sl染色体微卫星标记3个和7S1染色体标记4个；覃碧等[10]建立了2SlL染色体EST-STS标记5个；Cenci等[14]建立了3SlS染色体上与抗白粉病基因Pm13连锁的分子标记。未见对1Sl染色体分子标记建立的报道。本研究建立了1Sl染色体分子新标记9个，并且将9个标记被分别定位在1Sl染色体短臂或长臂上。重复试验表明，标记BE489692-EST-STS同时存在于1Sl短臂和长臂上，说明相应基因在1Sl染色体长臂或短臂上可能存在复制现象或1Sl长短臂上存在引物结合位点类似序列导致可重复性非特异扩增。对相应杂交群体的筛选结果表明，本研究建立的9个标记均能有效应用于分离群体的筛选和鉴定，可应用于涉及高大山羊草1Sl染色质导入小麦改良小麦子粒Fe和Zn含量选育高品质小麦的育种工作。

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