水稻OsLecRK基因RNAi载体的构建及遗传转化

闸雯俊 李三和 胡刚 等

摘要：凝集素类受体蛋白激酶（Lectin-like receptor kinase，LecRK）是一类植物特有并分布广泛的蛋白激酶。采用RT-PCR 从水稻（Oryza sativa L.）品种B5中克隆了OsLecRK基因靠近翻译起始位点下游的530 bp 的特异基因片段，将该片段以正、反向分别连入pKANNIBAL载体，从而获得pKAN-OsLecRK-RNAi的中间表达载体，进而将其克隆到植物双元表达载体pCAMBIA1301中，构建dsRNAi表达载体pCAMBIA-OsLecRK-dsRNAi。经酶切和测序鉴定正确后，利用农杆菌介导转化水稻，通过抗性筛选和标记基因hyg进行PCR鉴定，筛选出12株转基因水稻植株。

关键词：水稻（Oryza sativa L.）；RNAi；OsLecRK；遗传转化

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）20-5149-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.056

Construction and Genetic Transformation of RNA Interference Vectors

for OsLecRK Gene of Oryza sativa L.

ZHA Wen-jun， LI San-he， HU Gang， CHEN Zhi-jun， LIU Kai， ZHOU Lei， YANG Guo-cai， YOU Ai-qing

（Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement/Food Crops Institute，

Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract： Lectin-like receptor kinase（lecRK） is a family of proteins which is unique and universal in plants. A 530 bp gene specific fragment of OsLecRK was amplified using RT-PCR method from rice variety B5 and this fragment was linked both in sense and antisense directions to the vector of pKANNIBAL as junction fragment. The resulting construct was then cloned into plant binary expression vector pCAMBIA1301 to form dsRNAi expression vector pCAMBIA-OsLecRK-RNAi. After confirmation by enzyme digestion and sequencing analysis， this pCAMBIA-OsLecRK-RNAi was transferred into rice by agrobacterium-mediated transformation method. A total of 12 regenerated transgenic lines were screened through PCR identification of hyg gene.

Key words： Oryza sativa L.；RNA interference；OsLecRK；genetic transformation

水稻（Oryza sativa L.）是世界的主要粮食作物之一，全球超过一半人口以水稻作为主食[1]。水稻是中国最重要的口粮作物，常年种植面积约3 000万hm2，占世界水稻种植总面积的1/4。因此，水稻的种植安全与中国农村经济发展和口粮安全密不可分。

凝集素类受体蛋白激酶（lectin-like receptor kinase，LecRK）是一类植物特有并分布广泛的蛋白激酶。自1996年从拟南芥中第一次分离得到该家族成员Ath.lecRK1后，人们已从多种植物中克隆到多个该类蛋白基因。研究表明，LecRK基因对植物生长发育有一定的作用。拟南芥sgc是一种LecRK基因失活的突变体，由T-DNA插入At3g53810而引起，突变体sgc由花粉时期开始，所有的花粉粒都开始变形和萎缩，从而引起雄性不育[2]。LecRK基因还广泛参与植物与生物和非生物胁迫的互作。LecRK胞外的凝集素受体结构域一直被认为是与根瘤菌的共生和病原体的抵抗相关。最近的研究也证明了这个观点，新发现的水稻抗稻瘟病Pi-d2就是一种包含有甘露糖特异的凝集素受体蛋白激酶[3]。研究人员还利用T-DNA插入和RNAi方法将拟南芥中的LecRK4.1、LecRK4.2、LecRK4.3这3个基因分别敲除掉，结果显示任一基因的失活可增强拟南芥对萌发时ABA的应答[4]；与之相反，另一株突变体LecRK-b2在萌发时期对ABA的敏感度会降低，同时结果还发现LecRK-b2基因也参与发育早期对盐压力和渗透压的应答[5]。

RNAi（RNA interference）即RNA干扰（或RNA干涉），是在生物进化过程中遗留下来的，其在转录后通过 RNA 调控基因表达，在真核细胞中引入双链 RNA分子从而导致具有序列同源性的基因产生特异性基因沉默（Gene silencing）的现象。RNAi具有高效性和高度特异性，成为调控基因表达的新技术。因此，本研究旨在通过RNAi技术，研究OsLecRK下调的转基因水稻，为深入研究OsLecRK基因的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试品种 供试水稻品种为合江19，购自国家种质资源库，以下简称H1493。

1.1.2 质粒与菌种 大肠杆菌（E. coli）DH5α和农杆菌EHA105。所使用的载体包括pCAMBIA1301载体、pCU载体和pKANNIBAL载体，载体购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 工具酶及主要试剂 限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ、XbaⅠ、HindⅢ、pMD19-T 载体、T4 连接酶购自于宝生物工程（大连）有限公司。试剂：蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素购自于Sigama公司；Taq DNA polymerase、pfu DNA polymerase、dNTPs、DNA凝胶回收试剂盒等购自康为世纪生物科技（北京）有限公司；质粒小量快速提取试剂盒、核酸分子量 Marker 购自天根生化科技（北京）有限公司； 其余常规药品均为进口或国产分析纯。引物合成和测序由北京奥科生物技术有限公司完成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的获得 采用小量DNA提取方法提取水稻品种B5基因组 DNA。以B5基因组 DNA 为模板，OsLecRKXE和OsLecRKXH为引物，分别扩增两段OsLecRK 基因530 bp的顺式和反式片段。PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，上、下游引物（10 μmol /L）各 0.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s， 56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。将其PCR产物分别进行回收，回收片段经加尾 polyA后与克隆载体 pMD19- T载体连接，构建重组质粒，然后将其转化大肠杆菌DH5α。

1.2.2 RNAi重组载体的获得 扩增靶标片段连入pMD-19T载体测序正确后，从pMD19-T载体上使用XhoⅠ+EcoRⅠ双酶切切下顺向靶标片段（OsLecRK）并连入pKANNIBAL载体，构成载体pKAN- OsLecRK XE。同样从pMD19-T载体上使用XbaⅠ+HindⅢ双酶切切下反向靶标片段OsLecRK连入载体pKAN-OsLecRK XE，构成重组载体pKAN-（OsLecRK）2。目的片段以相反的方向克隆到pKANNIBAL载体的两个多克隆位点接头中，中间被Pdk内含子隔开，即形成dsRNAi片段。最后利用BamHⅠ酶切载体pKAN-（OsLecRK）2得到所需的dsRNAi片段，连入经BamHⅠ酶切的pUC载体，构成RNAi载体。

1.2.3 转基因水稻的获得鉴定 将构建好的重组质粒转化农杆菌EHA105，在含有50 μg/μL卡那霉素和50 μg/μL利福平的平板培养基上筛选，单菌落以OsLecRKXE为引物进行PCR鉴定。将鉴定正确的单菌落进行摇菌，待菌液为OD600 nm约0.5时，侵染预先培养好的日本晴愈伤组织，28 ℃暗培育2.5 d；将愈伤组织挑出放入无菌三角瓶中，用含500 mg/L头孢拉定的无菌水清洗干净；晾干后放入含500 mg/L潮霉素培养基上筛选15 d，共筛选2次；将培养基上能增生分裂的抗性愈伤组织转入分化培育基上，一周后愈伤组织开始转绿；将其转到装有分化培育基的三角瓶中，约3周后，愈伤组织长出嫩芽并生根；待根部发育粗壮、苗高约6～10 cm时，打开瓶盖进行炼苗；一周后移栽大田。

1.2.4 转基因水稻的鉴定 提取水稻的总DNA，具体步骤按试剂盒说明操作。以Hyg-F/Hyg-R为引物对进行抗性基因检测，PCR反应体系为：10×PCR反应缓冲液2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2 μL， MgCl2（25 mmol/L）2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，上、下游引物（10 μmol /L） 各0.5 μL，质粒1 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 RNAi干扰片段的克隆

以模式抗虫水稻品种B5 mRNA为模板，采用RT-PCR 扩增（NCBI accession number：Os04g 12560）

靠近翻译起始位点ATG带有特定限制性酶切位点的530 bp长的正反义片段，结果与预期片段大小相符（图1）。

2.2 OsLecRK RNAi载体的构建

分别选择OsLecRK基因编码区的530 bp作为该基因的目的片段，用于构建RNAi载体转化水稻。OsLecRK使用正向引物带有XhoⅠ+BamHⅠ酶切位点和反向引物带有EcoRⅠ酶切位点扩增靶标片段，连入pMD19-T载体测序正确后，从pMD19-T载体上使用XhoⅠ+EcoRⅠ双酶切切下靶标片段OsLecRK并连入pKANNIBAL载体，构成载体pKAN-OsLecRKXE（图2）。

然后再使用正向引物带有XhaⅠ+BamHⅠ酶切位点和反向引物带有Hind III酶切位点扩增靶标片段，pMD19-T载体测序正确后，从pMD-19T载体上使用XbaⅠ+Hind Ⅲ双酶切切下靶标片段OsLecRK连入载体pKAN-OsLecRKXE，构成载体pKAN-（OsLecRK）2（图3）。

目的片段以相反的方向克隆到pKANNIBAL载体的两个多克隆位点接头中，中间被Pdk内含子隔开，获得pKAN-OsLecRK-RNAi的中间表达载体。使用BamHⅠ酶切载体pKAN-（OsLecRK）2，得到dsRNAi片段，连入经BamHⅠ酶切的pCU载体，构成RNAi载体（OsLecRK-RNAi）（图4）。

2.3 转基因植株的获得

利用农杆菌介导的遗传转化方法，将构建好的RNAi载体（OsLecRK-RNAi）利用电转化的方法导入农杆菌菌株EHA105中，以粳稻品种合江19为受体进行遗传转化水稻。以靶标基因和潮霉素设计引物，通过PCR进行鉴定OsLecRK-RNAi（图5），获得OsLecRK-RNAi阳性转化植株。

3 小结与讨论

RNA干扰（RNA interference， RNAi）技术是反向遗传学重要的试验技术手段之一，具有特异性和高效性，是研究基因功能的有效途径之一[6]，它的应用为阐明基因生物学功能提供了有利的工具。相关研究表明，有效的靶基因片段对 RNA干扰的成功非常重要，基因片段长度在 23～1 000 bp间都能获得良好的沉默效果[7]。

为了研究和验证OsLecRK基因的生物学功能，通过反向遗传学的方法，敲除水稻OslecRK基因，构建了RNAi抑制转基因株系，为进一步研究奠定基础。

参考文献：

[1] KHUSH G S. Origin，dispersal，cultivation and variation of rice[J].Plant Mol Biol，1997，35（1-2）： 25-34.

[2] WAN J， PATEL A， MATHIEU M，et al. A lectin receptor-like kinase is required for pollen development in Arabidopsis[J].Plant Molecular Biology，2008，67： 469-482.

[3] CHEN X，SHANG J，CHEN D，et al. A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance[J]. The Plant Journal， 2006， 46：794-804.

[4] XIN Z，WANG A，YANG G，et al. The Arabidopsis A4 subfamily of lectin receptor kinases negatively regulates abscisic acid response in seed germination[J]. Plant Physiology， 2009，149：434-444.

[5] DENG K，WANG Q，ZENG J，et al. A lectin receptor kinase positively regulates ABA response during seed germination and is involved in salt and osmotic stress response[J]. Journal of Plant Biology， 2009， 52：493-500.

[6] MIKI D， ITOH R， SHIMAMOTO K. RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice[J]. Plant Physiology， 2005， 138（4）： 1903-1913.

[7] WESLEY S V， HELLIWELL C A， SMITH N A ，et al. Construct design for efficient， effective and high-throughput gene silencing in plants[J]. Plant Journal， 2001， 27（6）：581-590.