黑木耳液体发酵菌株筛选及发酵特性分析

范秀芝 陈丽冰 史德芳 等

摘要：以菌丝长速和浓密程度、液体发酵菌丝体生物量及多糖产量为考核指标，从22个国审黑木耳（Auricularia auricula-judae）品种中筛选高产多糖的菌株，并对其发酵特性进行分析。结果表明，黑木耳2号菌株菌丝浓白、生长速度快，在基础发酵培养基中获得多糖产量是其他菌株的2倍以上，是较优的液体发酵高产菌株；发酵第五天多糖产量最高，在后续培养基和培养条件优化试验中可在此时终止发酵。

关键词：黑木耳（Auricularia auricula-judae）；液体发酵；多糖；菌株筛选

中图分类号：S646.6；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）20-5117-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.049

Screening of Auricularia auricula-judae Strain with High Polysaccharide Contents for Liquid Fermentation and Analysis on the Fermentation Characteristics

FAN Xiu-zhi，CHEN Li-bing，SHI De-fang，CHENG Wei，HE Jian-jun，GAO Hong

（Institute of Agri-Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064， China）

Abstract：Using mycelial growth rate， colony dense degree， liquid mycelium biomass and polysaccharide production as assessment indicator， high polysaccharides yield Auricularia auricula-judae strain was screened from 22 state approved strains， and the fermentation characteristics of the selected strain was analyzed. The results demonstrated that the polysaccharide production of HME2 with thick white and growth fast mycelia was two times more than that of other strains in basic fermentation medium， which showed that HME2 was the optimum liquid fermentation producing strain. The highest polysaccharide yield of HME2 was obtained at the 5th day， indicating that in the subsequent optimization of fermentation culture media and conditions test could be terminated at this time.

Key words： Auricularia auricula-judae； liquid fermentation； polysaccharide； strain selection

黑木耳（Auricularia auricula-judae）又名木耳、云耳和光木耳，是一种质地柔软、口感细嫩、味道鲜美、营养丰富的食用菌，含有大量的碳水化合物、蛋白质、钙、磷、铁、胡萝卜素、维生素等营养物质。同时，也含有多种生物活性物质，是一种重要的药用菌，被称为益寿延年的妙药和抗癌新兵[1]。黑木耳多糖是黑木耳中研究最多的活性物质。研究表明，黑木耳多糖可以促进巨噬细胞吞噬功能，增强机体免疫能力[2]；通过诱发细胞程序性死亡来抑制癌细胞增殖[3]；抗氧化、防衰老，并可通过抗氧化活性增强心脏功能[4]；有食品阿司匹林之称，抗凝血、抗血栓，还可以降血糖、降血脂、降低胆固醇，有利于防治高血脂、动脉硬化，减少心血管疾病的发生，另外还有抑菌、抗炎镇痛、抗辐射和抗突变等多种功效[5-8]。

从黑木耳子实体中提取胞内多糖是获得黑木耳多糖的主要方法，但考虑到黑木耳的生产受季节和气候的影响较大，而且栽培周期长，劳动强度大，提取工艺繁琐以及提取率低等因素，不少研究者将目光转向能够短时间高效获取目的代谢产物，而且不受季节、地域和时间限制，并可规模化、工业化生产的液体深层发酵技术[9，10]。但是不同黑木耳品种间多糖含量差异较大[11]，因此本研究以菌丝体形态、生物量及胞内外多糖产量为考核指标，筛选适用于液体发酵的黑木耳高产多糖菌株，并对发酵特性进行分析，为进一步利用液体深层发酵技术获得黑木耳多糖奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

22株国审黑木耳菌株（表1）由华中农业大学应用真菌研究所保藏并提供。通过活化后比较在90 mm平板中菌丝生长速度和浓密程度，选择其中7株用于高产多糖黑木耳液体发酵用菌株的筛选。

1.2 培养基与试剂

完全培养基（CYM）：葡萄糖20 g，蛋白胨2.0 g，酵母膏2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 0.46 g，琼脂15～20 g，加蒸馏水定容至1 L，高压灭菌备用。

液体完全培养基（LCYM）：不添加琼脂的CYM。

基础发酵培养基（BFM）：葡萄糖20 g，酵母膏2.0 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，加蒸馏水定容至1 L，高压灭菌备用，自然pH。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化 将4 ℃保存的菌株分别转接到90 mm 含CYM平皿上，25 ℃恒温培养5 d，用直径8 mm打孔器沿边缘取相同菌龄的菌块备用。

1.3.2 菌株长速测定和菌落形态 取直径8 mm的菌块，菌丝面向上接种到90 mm CYM平皿中央，在平皿底划“+”线，于25 ℃恒温培养，至第一个平皿长满后停止培养，观察菌株的菌落形态、菌丝浓密程度。并采用十字交叉法测量菌落平均直径，计算各菌株的菌丝生长速度（mm/d）。每个试验重复3次。

1.3.3 菌球直径和生物量测定 将“1.3.1”中获得的8 mm的菌块接种到50 mL LCYM中用于发酵种子液，25 ℃静置培养5 d。培养结束后用匀浆器将菌丝匀浆，并按10%的接种量将匀浆液接种到100 mL基础发酵培养基中，25 ℃、150 r/min振荡培养6 d。每个试验重复3次。培养结束，将培养基连同菌球经6 000 r/min离心10 min，收集菌液，并用蒸馏水清洗菌球2遍。随机选取10个菌球排成直线用游标卡尺测其直径。60 ℃烘干至恒重，称菌球生物量干重。

1.3.4 胞内和胞外多糖测定 菌体胞内多糖提取、标准曲线制定及含量测定参照文献[12]。胞外粗多糖及纯度测定：将“1.3.3”中收集的菌液旋转蒸发浓缩至30～40 mL，加入4倍体积无水乙醇，4 ℃沉淀过夜。6 000 r/min离心10 min弃上清液，沉淀用无水乙醇洗涤2次。将沉淀烘干至恒重，得胞外粗多糖。粗多糖研碎后称取0.050 0 g用蒸馏水溶解后定容至100 mL。适当稀释后按照文献[12]进行测定，计算得到胞外粗多糖含量。多糖含量以葡萄糖计，葡萄糖标准曲线的绘制采用苯酚硫酸法。

1.3.5 菌株发酵特性分析 选定8 d为一个培养周期，对培养周期中菌球干重、胞内和胞外粗多糖含量、pH以及还原糖含量进行测定。还原糖含量测定参照文献[13]。

2 结果与分析

2.1 不同菌株菌丝生长速度和菌落形态比较

7个菌株的菌丝生长速度差异显著，菌丝生长速度最快的是黑耳5号（图1A）。菌落形态可分为3类：新科和单片5号菌丝较稀疏（++），气生菌丝较发达；黑木耳2号、黑耳5号和黑793，菌丝平贴，浓白致密（++++）；黑威981和Au8129菌丝浓密度介于前两组之间（图1B）。菌丝生长速度与菌落形态间无明显相关性。通过比较选择黑木耳2号、黑耳5号和黑793菌株用于液体发酵菌株的复筛。

2.2 葡萄糖标准曲线

紫外分光光度计在波长490 nm处测得葡萄糖含量，线性回归处理后，绘制葡萄糖溶液的标准曲线如图2所示，其回归方程为：y=9.452 9x-0.002 5（R2=0.999 7），标准曲线线性关系良好。

2.3 液体发酵菌球直径、生物量、胞内和胞外多糖含量比较

发酵培养6 d后的复筛菌株菌球直径、生物量、胞内和胞外粗多糖含量测定结果见表2。从表2中可以看出，同样条件下黑木耳2号的菌球直径最小，但生物量、胞内和胞外粗多糖含量最高，其发酵多糖总量为1.239 g/L。因此，选择黑木耳2号用于后续发酵试验研究。

2.4 黑木耳2号菌株发酵特性分析

配制葡萄糖标准溶液，采用紫外分光光度计测定540 nm处吸光度，得葡萄糖标准曲线为：y=15.665x-0.020 5（R2=0.998 5）。

在基础发酵培养基培养8 d的一个周期内，黑木耳2号菌株的生物量从第二天开始呈上升趋势，在第七天达到最大，为8.40 g/L；但菌丝体胞内多糖含量存在差异，随培养时间延长呈现出先增加后减少的趋势，在第五天达到最高（图3A）。发酵液内胞外粗多糖含量随培养时间增加不断增加，但其多糖纯度存在差异，第五天粗多糖的纯度最高，多糖产量也最高，胞外多糖产量在达到峰值后略有下降。基础发酵培养基自然条件下pH偏酸（5.04），在发酵过程中随菌丝体生长，pH不断下降。发酵过程中，葡萄糖的利用呈直线下降，在第八天培养结束后，葡萄糖残留量为5.02 g/L，利用率约为75%。综合考察发酵过程中生物量、胞内和胞外粗多糖含量，在后续的培养基和培养条件优化试验中，以多糖为评价指标时，应选择摇瓶发酵时间为5 d。

3 讨论

不同黑木耳品种间多糖含量差异较大，本试验在有限的菌株范围内筛选到多糖产量高的黑木耳2号菌株，但因培养基为基础发酵培养基、培养条件人为设定，使得所得的生物量和胞外粗多糖含量都比其他报道低。已知多糖的合成与培养基及培养条件关系很大，因此在后续试验中需要对培养基和培养条件进行优化，以获得更高的生物量和多糖产量，以便于进一步加工和利用。

pH是影响多糖产生的一个重要因素：蜜环菌产多糖的最适初始pH 5.0；灵芝产胞外多糖的最适初始pH为5.5，且在发酵过程中控制pH在4.0时，胞外多糖的产量最高[14]。据报道，黑木耳菌丝体较适合偏酸性环境，在初始pH 4.5～5.5时适宜生长[15]，因此后续发酵条件优化试验中可直接选择初始pH 5.0左右。

本研究中，利用黑木耳2号在基础发酵培养基中发酵多糖产量最高是在第五天，胞外纯多糖仅占多糖总量的26.96%，远低于王国良等[16]发酵生产黑木耳多糖时的99.77%，这一差异的出现是否与培养基和培养条件有关还需进一步探明。发酵第五天，基础培养基中葡萄糖剩余量为9.89 g/L，利用率只有50.55%，但胞内、胞外多糖产量已达到最高值，因此，在将含有残留葡萄糖的发酵液直接用于产品开发研究中，葡萄糖利用率不会成为限制因素。

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