咪唑离子液体对四尾栅藻的毒性

吴 洁，陈晓娣，邓 芸，朱 凯，韩萍芳，顾 军

（1.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800；2.南京大学昆山创新研究院，江苏 昆山 215347；3.南京大学 物理学院，江苏 南京 210093）

咪唑离子液体对四尾栅藻的毒性

吴 洁1，2，陈晓娣1，2，邓 芸2，3，朱 凯2，3，韩萍芳1，顾 军2，3

（1.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800；2.南京大学昆山创新研究院，江苏 昆山 215347；3.南京大学 物理学院，江苏 南京 210093）

按照藻类生长抑制试验标准方法，以四尾栅藻为受试生物，研究了离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（［C4mim］［Cl］）和1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（［C4mim］［BF4］）对四尾栅藻的影响，测定了半数有效浓度（EC50）和叶绿素含量。结果表明：［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］对四尾栅藻的生长和叶绿素的产生均具有抑制作用，毒性效应随着浓度的增大和培养时间的增长而增加，96 h的EC50分别为57.8和38.8mg/L。离子液体质量浓度为200mg/L时，四尾栅藻的叶绿素总量仅为对照组的32%和26%。此结果可以说明离子液体对生态系统存在潜在的负面效应。

四尾栅藻；离子液体；毒性；半数有效浓度EC50；叶绿素含量

离子液体是一类完全由离子组成的有机盐，熔点低于100℃［1］，通常由体积相对较大且结构不对称的有机阳离子和体积较小的无机或有机阴离子组成［2-4］。离子液体没有明显的蒸气压，可以减少对大气的污染和对操作人员的危害，因而被称为是“绿色溶剂”［5］，在生物催化、合成化学、电化学领域和分析领域，如分离、提取、电解、传感和光谱测定，都有广泛的应用前景。

随着研究的深入，人们逐渐认识到离子液体虽然被称为“绿色溶剂”，但实际上存在许多“绿色问题”［6］。有文献指出离子液体对生物，如细菌、藻类、植物、鱼类和动物等都有一定的毒性［7］。而且考虑到离子液体具有良好的化学和热力学稳定性，离子液体一旦被排放或意外泄漏到环境中，就有可能成为一种新的持久性污染物而长期存在水和土壤中，从而污染环境［8］。

由于某些离子液体较好的水溶性［9］，其对水环境的影响不容忽视［7］。目前，离子液体对大型蚤、斑马鱼、蚯蚓和卤虫等的毒性研究已有很多报道［10-14］，而关于咪唑离子液体对藻类的毒性研究的国内报道还较少。藻类是整个生态系统物质循环和能量流动的重要基础，其本身的生长和代谢会直接受到污染物的影响，进而影响到初级消费者及高级消费者的正常生长和生理代谢过程。藻类对许多毒物的敏感性要超过鱼类或甲壳类，而且藻类具有生长周期短、易培养［15］、可直接观察细胞水平上的毒性症状等特点；同时藻类的生物测定与其他生物的测定方法相比，相对简单、快速［16］。四尾栅藻是一种常见的淡水藻，易在实验室培养，且对外界环境变化敏感，因此在毒理学研究中常作为指示生物［17］。

本文中，笔者按照藻类生长抑制实验，进行了2种咪唑类离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（［C4mim］［Cl］）和1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（［C4mim］［BF4］）对四尾栅藻的毒性试验，测定生长速率和叶绿素含量，比较两种阴离子对微藻的毒性的影响，以期为完善该类物质的环境影响评估提供理论数据。

1 材料和方法

1.1 生物材料

四尾栅藻（Scenedesmus quadricauda，FACHB-1297）购自中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库。将藻种接种至灭菌的BG11培养基（BG11配方由中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库提供）中，于人工气候室内的摇床上进行培养和扩大繁殖，培养温度（25±1）℃，光照为2 500 lx，光暗比为12 h∶12 h，摇床的摇速设定为120r/min。

BG11培养液配方（1 L）：NaNO31.5g、K2HPO40.04g、MgSO4·7H2O 0.075g、CaCl2·2H2O 0.036g、柠檬酸 0.006g、柠檬酸铁铵 0.006g、EDTANa20.001g、Na2CO30.02g、A5微量溶液1mL。

A5微量溶液配方（1 L）：H3BO32.86g、MnCl2· 4H2O 1.86g、ZnSO4·7H2O 0.22g、CuSO4·5H2O 0.08g、Co（NO3）2·6H2O 0.05g。

1.2 受试离子液体

1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（［C4mim］［Cl］）和1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（［C4mim］［BF4］）均购于上海成捷化学有限公司，1H NMR测试纯度大于99%。

1.3 实验方法

实验方法按照国家环保局“化学品测试方法”中的藻类生长抑制实验［18］进行。离子液体的试验浓度为20、50、100和200mg/L，每个浓度设3个平行。所用玻璃器皿和培养液均经过 0.1 MPa、121℃、25min灭菌。实验所用容器为250mL锥形瓶，培养量100mL。取对数生长期的藻液进行接种，初始光密度OD680＞0.1。每天定时测四尾栅藻的光密度，并取样测其叶绿素。

1.4 分析测定方法

1.4.1 半最大效应浓度（EC50值）

用紫外可见分光光度计在680 nm处测定藻液的光密度（OD680）表示四尾栅藻的生长，并用血球计数板进行计数，建立光密度和细胞数之间的关系。根据μ=（ln Nt-ln N0）/（t-t0）计算四尾栅藻的生长速率μ，N0为试验开始时（t0）的藻密度；Nt为试验开始后（t）时间的藻密度；而生长抑制率 B=［（μbμtox）/μb］×100%，μb为对照组的生长速度，μtox为试验组的生长速度。采用概率单位法［19］计算EC50，即通过查表，先将计算出的生长速率换算成概率单位，然后将离子液体的浓度对数与概率单位进行一元线性回归，得到离子液体-四尾栅藻的剂量-反应方程，当概率单位为5时，通过回归方程计算EC50。

1.4.2 藻类叶绿素含量

根据《水和废水监测分析方法》［20］中叶绿素的测定方法，并加以改进。取一定量的藻液进行离心，弃上清液，在沉淀中加入2～3mL 90%丙酮，用组织研磨器充分研磨后，4 000r/min离心10min，上清液倒入10mL具塞试管中。再用2～3mL 90%（体积分数）丙酮继续研磨提取叶绿素。离心后，上清液再转入10mL具塞试管中。重复以上操作1～2次，用90%丙酮定容至10mL，摇匀，最后，将上清液在分光光度计上，用1cm光程的比色皿，以90%丙酮作为空白进行校零，分别测定663和645 nm波长下的吸光度OD663和OD645。

根据文献［21］计算叶绿素含量见式（1）～式（3）。

式中：ρa（Chl a）为叶绿素a的质量浓度，mg/L；ρb为叶绿素b（Chl b）的质量浓度，mg/L；ρT为总的叶绿素质量浓度，mg/L。

1.5 数据分析

试验获得的原始数据经Excel 2007处理后，使用Origin 8.1作图；使用 SPSS 13.0进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 毒性效应曲线

图1为［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］咪唑离子液体在不同浓度条件下对四尾栅藻生长的影响曲线。

图1 离子液体对四尾栅藻生长影响曲线Fig.1 Effects of ionic liquids on growth of S.quadricauda

由图1可知：离子液体对四尾栅藻生长的抑制作用随浓度的增加而增强，与对照组相比，不同试验浓度下的四尾栅藻在测试时间内的生长均受到抑制，各个浓度下的四尾栅藻在2 d内长势较慢，但随着时间的延长，长势开始出现差异：低浓度下（20mg/L和50mg/L）的藻虽受影响但仍然缓慢生长；高浓度的离子液体对藻的抑制作用较强，因而藻的生长趋势趋于平缓，有下降趋势。

2.2 EC50值测定结果

通过概率单位法计算得到的离子液体对四尾栅藻的各时间下的剂量-反应方程和EC50，结果见表1。

表1 ILs对四尾栅藻的剂量-反应方程Table 1 The line dose-response equation for S.quadricauda

由表1可知：各时间的剂量-反应方程的线性相关性均良好。在试验期间内，［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］的 EC50值从369.4和231.2mg/L（24 h）分别减小到57.8和38.8mg/L（96 h），抑制作用随着时间的延长而增强。根据藻类生长抑制的急性毒性标准［22］进行分级，96 h的EC50均大于10mg/L 且小于 100mg/L，［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］对四尾栅藻的毒性属于级别3。

图2 离子液体对四尾栅藻的叶绿素含量的影响Fig.2 Effects of ionic liquids on chlorophyll content of S.quadricauda

2.3 离子液体对四尾栅藻叶绿素含量的影响

图2表示2种离子液体处理四尾栅藻96 h后的叶绿素总量的变化。由图2可知：在试验浓度范围，2种离子液体对四尾栅藻叶绿素的产生均有较强的抑制作用。随着离子液体浓度的增强，叶绿素总量逐渐减小，［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］质量浓度为200mg/L时，四尾栅藻的叶绿素总量仅为对照组的32%和26%。

而2种离子液体处理四尾栅藻96 h后的叶绿素a和叶绿素b的变化如表2所示。由表2可知：随着离子液体的浓度增加，四尾栅藻的叶绿素a和叶绿素b的含量总体呈下降趋势。各浓度下的四尾栅藻的叶绿素a和叶绿素b的含量与对照组相比，差异都达到了显著性水平（p＜0.05），说明离子液体对藻的叶绿素的影响极显著。离子液体浓度的升高导致了藻细胞生长受到抑制，叶绿素含量逐渐减少。这可能是因为离子液体透过四尾栅藻的细胞壁，结合在磷脂双分子膜结构表面［23］，破坏了膜蛋白的结构［24］和叶绿体结构的完整性［25］，从而影响了叶绿素的合成。段炼等［26］通过观察藻细胞的超微结构发现，离子液体的加入会破坏藻细胞叶绿体的结构，导致叶绿体片层结构断裂，从而使叶绿素合成受阻，藻细胞内叶绿素含量减少。

表2 离子液体处理96 h后四尾栅藻的叶绿素a和b含量Table 2 The chlorophyll a and chlorophyll b content of S.quadricauda after 96 h ionic liquids exposure

综合图2和表2可以看出，［C4mim］［BF4］比［C4mim］［Cl］对四尾栅藻的毒性大。相同阳离子的离子液体，毒性差异主要是阴离子的影响，因而阴离子［BF4］-的毒性比［Cl］-的强，这与Cho等［16］的研究结果一致。这可能是因为［BF4］-水解后产生了F-，导致其毒性增大，Phuong等［15］用离子色谱法证实了F-的存在。而且F-是位于细胞表面的Na+_K+_ATP酶的抑制剂，会干扰细胞基本的自我修复过程［27］，但具体机制还不清楚。

2.4 离子液体对四尾栅藻细胞形态的影响

图3为不同浓度离子液体处理藻细胞后，细胞形态变化的照片。由图 3可知：含有低浓度（20mg/L）离子液体的藻液，出现栅藻细胞膨胀和破碎的时间晚，且膨胀和破碎的藻细胞少，藻液颜色与未含离子液体的藻液相比，颜色偏黄；而随着离子液体浓度的增加，破碎和膨胀的藻细胞逐渐增多，当离子液体质量浓度为200mg/L时，出现大量细胞空壳，藻液颜色发白。

这是因为咪唑离子液体的阳离子结构与阳离子表面活性剂相似［15，26］，一端是亲水的咪唑基团，一端是亲油的烷基链。表面活性剂对藻细胞的作用主要是其吸附在磷脂双分子膜结构表面，引起膜脂结构的破坏及其功能的丧失［28］。离子液体对藻细胞的影响与表面活性剂的影响类似：离子液体透过藻细胞的细胞壁，结合到膜脂结构表面，影响了细胞膜的正常功能，导致细胞畸形生长，出现了膨胀现象［23］，当细胞膨胀到一定程度，则有可能撑破细胞壁束缚而破碎。

图3 离子液体处理96 h后的藻细胞形态的影响Fig.3 The cell morphology change of S.quadricauda after different concentration ionic liquids exposure

3 结论

研究［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］离子液体对四尾栅藻的毒性效应，［C4mim］［BF4］比［C4mim］［Cl］对四尾栅藻的毒性大，且毒性随着时间的延长而增强。具体表现为 EC50值逐渐减小：［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］的EC50分别从369.4mg/L和231.2mg/L（24 h）减小到57.8mg/L和38.8mg/L（96 h）。加入［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］后处理96 h，对应的EC50值均大于10mg/L且小于100mg/L，根据藻类生长抑制的急性毒性分级标准，对四尾栅藻的毒性属于级别3。

在0～200mg/L范围内，离子液体［C4mim］［Cl］和［C4mim］［BF4］对四尾栅藻生长的抑制作用随浓度的增加而增强，叶绿素含量也随之下降。

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（责任编辑 荀志金）

Toxicity of imidazolium-based ionic liquids to Scenedesmus quadricauda

WU Jie1，2，CHEN Xiaodi1，2，DENG Yun2，3，ZHU Kai2，3，HAN Pingfang1，GU Jun2，3
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China；
2.Kunshan Innovation Institute of Nanjing University，Kunshan 215347，China；3.School of Physics，Nanjing University，Nanjing 210093，China）

Toxic effects of ionic liquids 1-butyl-3-methylimidazolium chloride（［C4mim］［Cl］）and 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate（［C4mim］［BF4］）on Scenedesmus quadricauda were studied by using alga growth inhibition test.Two endpoints EC50values and chlorophyll contents were determined. The results indicate that［C4mim］［Cl］and［C4mim］［BF4］limited the growth and chlorophyll content of S.quadricauda，the toxic effects increased with the concentration and incubation time.The 96 h EC50was 57.8 and 38.8mg/L，respectively.When adding 200mg/L ionic liquid，the total chlorophyll content of S.quadricauda were only 32%and 26%respectively，compared with the control group.Our findings imply the potential adverse effect of ionic liquids on the ecological system.

Scenedesmus quadricauda；ionic liquids；toxicity；EC50；chlorophyll content

Q93

A

1672-3678（2015）02-0076-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.02.015

2013-08-13

江苏省自然科学基金（BK2012218）

吴 洁（1989—），女，江苏常州人，硕士研究生，研究方向：微生物学；韩萍芳（联系人），教授，E-mail：hpf@njtech.edu.cn