高粘附性戊糖片球菌的筛选、标记及其表面疏水与自凝聚性特征

杨振泉，靳彩娟，张咪，王晓霖，高璐，顾瑞霞

（1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州225127；2.江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏扬州225127）

高粘附性戊糖片球菌的筛选、标记及其表面疏水与自凝聚性特征

杨振泉1，2，靳彩娟1，张咪1，王晓霖1，高璐1，顾瑞霞1，2

（1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州225127；2.江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏扬州225127）

通过常规乳酸菌分离技术结合形态观察、生理生化试验，以及16S rDNA同源性分析等方法，从臭豆腐发酵卤水中分离获得7株戊糖片球菌分离株，并通过随机扩增多态性DNA技术构建了不同菌株的特征指纹图谱；以Caco-2细胞和固定化肠黏液蛋白质作为体外模型，研究了菌株的粘附能力，并探讨了菌株粘附能力与基因型以及表面疏水性、自凝聚能力等表型特征的相关性。结果显示，发酵卤水中的戊糖片球菌存在高度分子多样性，7个分离株中存在6种不同的指纹图谱模式，其中A5型菌株（F28-8和Y27-4）对Caco-2细胞和肠黏液蛋白质的粘附性最强，并显示了高度的疏水性（＞90%）和较强的自凝聚能力（＞25%）。相关性分析表明，戊糖片球菌表面疏水率和自凝聚率与Caco-2细胞粘附率测定结果呈显著正相关（r=0.900和0.792，P＜0.05），但是与肠黏液蛋白质粘附率测定结果相关性不显著（r=0.426和0.700，P＞0.05）。研究成果为建立高粘附性戊糖片球菌快速筛选方法及其体内定植和分布研究提供了依据。

戊糖片球菌，粘附性，表面疏水性，自凝聚能力，DNA指纹图谱

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）广泛分布于腌制和泡制蔬菜、干酪、香肠等传统发酵食品中，对提高发酵食品的营养、风味及安全性具有重要作用［1-2］。该菌代谢糖类产生乳酸，并产生IIa类片球菌素，对病原菌及腐败微生物产生强烈的抑制效应［3］。已有的研究表明，戊糖片球菌的一些菌株具有提高机体的天然免疫能力、促进健康以及抵抗病原菌的侵袭等益生特性［4-5］，具有用于人类或动物的微生态制剂的开发潜力。菌株粘附能力是微生态制剂在肠道发挥生态效应和生理作用的重要基础，筛选高粘附性菌株对微生态制剂开发具有重要意义，但目前国内外对戊糖片球菌粘附特性及其机制的研究尚不多见。利用人结肠癌细胞系Caco-2评价乳酸菌的粘附能力是目前广泛使用的体外模型和方法［6］，但是没有考虑到肠道内覆盖在肠上皮细胞外层的肠黏液的作用［7］，固定化小肠黏液蛋白质模型能够反映乳酸菌在体内与肠黏液的作用［8］，结合这两种模型可以较好地评价乳酸菌的粘附特性，但是这两种模型需要复杂的细胞培养和实验动物操作，价格昂贵，不利于大规模的菌株筛选。

细菌表面疏水性和自凝聚性与粘附特性密切相关。表面疏水性是决定细菌非特异性粘附到生物表面的重要动力，在乳酸菌向肠壁粘附和定植的过程中发挥重要的作用［9］。自凝聚特性有助于细菌形成生物膜并在宿主肠道定植，阻止病原菌的粘附和侵袭，并且与致病菌的清除存在一定关联［10］。目前已有研究表明，在部分双歧杆菌和乳酸杆菌菌种中，基于菌株的表面疏水性和自凝聚能力与其对肠上皮细胞粘附能力的相关性，可以应用简单廉价的凝聚性和疏水性测定方法替代昂贵的细胞和动物评价模型对菌株的粘附能力进行预测和初步筛选［11］，对从大量菌株中筛选高粘附性菌株，缩小试验范围和降低成本具有重要意义。但是，目前对于戊糖片球菌的粘附能力和表面疏水性以及自凝聚能力之间的相关性还需要进一步数据证实。本研究中从臭豆腐发酵卤水中分离鉴定了7株戊糖片球菌，通过Caco-2细胞和固定化小肠黏液蛋白质模型，比较了不同菌株的粘附能力，并探讨了粘附能力与菌株基因型、表面疏水性以及自凝聚特性的相关性，为高粘附性戊糖片球菌菌株高效定向筛选及微生态制剂开发提供了候选菌株和依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂PCR试剂、溶菌酶、蛋白酶K，均购自上海生工生物工程有限公司；MRS培养基以及细菌生化鉴定试剂，广州环凯生物试剂有限公司产品；细菌16SrDNA扩增引物8F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和15R：5’-AAGGAG GTGATCCAGCCGCA-3’，以及DNA指纹图谱扩增随机引物M13：5'-GAGGGTGGCGGTTCT-3'和M14：5'-GAG GGTGGGGCCGTT-3'，均由上海生工生物工程有限公司合成；其它化学试剂均为国产分析纯。

1.1.2主要仪器设备ABI2720型热循环仪，美国Life Technologies公司制造；凝胶成像系统，法国Vilber Lourmat公司制造；UV-7504C分光光度计，上海欣茂仪器有限公司制造；Elx-800型酶标仪，美国Bio-Tek公司制造；显微镜，日本Olympus公司制造；S-4800型场发射扫描电镜，日本日立公司制造；Heracell 240i CO2培养箱，美国Thermo Scientific公司制造。

1.1.3细胞与实验动物Caco-2细胞株，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；DMEM培养液、胎牛血清、质量分数0.25%胰蛋白酶、DHank′s缓冲液，均购自GIBCO公司；青霉素和链霉素，美国Sigma公司产品；6周龄ICR实验小鼠，购自扬州大学比较医学中心。

1.2方法

1.2.1戊糖片球菌的分离及生理生化鉴定臭豆腐发酵卤水样品分别采集自扬州本地不同臭豆腐生产作坊。发酵卤水样品充分混匀后用灭菌生理盐水10倍稀释。吸取250 μL不同稀释度样品液涂布含有质量分数0.75%CaCO3的MRS平板，放入厌氧罐，37℃恒温培养48 h，选择分离程度较好的平板挑取有溶钙圈的单菌落，在MRS平板上反复划线纯化，按文献［12］所述的方法对接触酶阴性、产酸的革兰氏阳性球菌进行耐盐性、温度、耐酸碱、动力学以及糖和氨基酸发酵试验，细菌的细胞微观形态采用扫描电镜观察。

1.2.2细菌基因组DNA提取基因组DNA的制备按文献［13］所述的CTAB法进行，并作适当改良。吸取48 h培养物1.5 mL置于离心管中，10 000 r/ min离心5 min，收集细胞；细胞用TE缓冲液洗涤2次后重悬于567 μL TE缓冲液中，加入30 μL质量分数10%SDS和5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，颠倒混匀，37℃温育1 h；加入100 μL 5 mol/L的NaCl溶液，混匀后加入80 μL CTAB-NaCl溶液，65℃水浴10 min。用酚-氯仿-异戊醇（体积比25∶24∶1）抽提两次，上清液加2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3 mol/L NaAc，-20℃静置1 h；10 000 r/min离心5 min收集沉淀，用体积分数70%乙醇洗涤两次，沉淀经真空冷冻干燥2 h后用40 μL TE缓冲液溶解，加入1 μL 10 mg/L的RNA酶，37℃消化1 h。提取物用核酸测定仪测定总DNA浓度，-20℃保存备用。

1.2.316S rDNA PCR扩增与测序鉴定以细菌基因组DNA为模板进行16S rDNA的PCR扩增。PCR反应体系（50 μL）包括：2 μL模板（50 ng/μL）、2 μL dNTPs（10 mmol/L）、引物8F（10 pmol/μL）和15R（10 pmol/μL）各2.0 μL，以及5 μL 10×Buffer、5 μL MgCl2（25 mmol/L）、0.3 μL Tag酶（5 U/μL），最后加ddH2O补足至50 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，50℃退火35 s，72℃延伸2.0 min，35次循环；72℃延伸10 min。取7.0 μL PCR产物用质量分数1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，其余PCR产物委托上海生物工程有限公司测序，所得序列在GenBank（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov）数据库中进行在线比对，序列同源性大于99%设为相同种。

1.2.4菌株分子指纹图谱鉴别菌株之间的基因型差异通过RAPD指纹图谱鉴别。以细菌基因组DNA为模板，应用M13和M14随机引物进行RAPD扩增。将DNA提取物用ddH2O稀释至100 ng/μL，随机引物浓度稀释至10 pmol/μL；优化的PCR扩增反应体系为：模板2.0 μL，dNTPs 0.5 μL，随机引物2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，MgCl22.5 μL，Tag酶0.3 μL，ddH2O 15.7 μL；RAPD反应循环参数为：95℃预变性2 min，94℃变性1 min；53℃退火1 min；72℃延伸1 min，30个循环；72℃补充延伸8 min。取10 μL产物在质量分数1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳（电压5 V/cm）1.5 h，EB染色20 min，凝胶成像系统拍照记录，根据条带清晰程度、弥散背景以及带型强弱情况选择稳定的指纹图谱进行分析。

1.2.5指纹图谱聚类分析根据在指纹图谱中同一迁移率位点上的扩增条带的“有”和“无”进行数字化处理，用“1”表示“有”，“0”表示“无”，建立矩阵，应用DPS7.05数据处理系统中的0-1系统聚类分析程序，选择Nei氏遗传距离和类平均法进行聚类分析。

1.2.6菌株表面疏水性测定参照文献［8］应用微生物粘着碳氢化合物（Microbial Adhesion To Hydrocarbons，MATH）法测定菌株的表面疏水性。取36 h细菌培养物4 000 r/min离心10 min收集菌体，生理盐水洗涤两次，5 000 r/min离心10 min。以生理盐水调整受试菌株菌液浓度，使菌悬液在600 nm波长下A值约为1.0（A600=1.0）。取2 mL菌悬液与2 mL二甲苯混合，涡旋120 s，室温静置30 min分层。取1 mL水相，以生理盐水为空白对照组，测定A600，每株细菌平行做3管重复。细菌表面疏水率（CSH）计算：

式（1）中：H即CSH，A0和A分别是与二甲苯混匀前后水相测定所得的A600值。

1.2.7菌株自凝聚能力测定菌株自凝聚能力测定参照文献［14］进行。菌株悬液制备同1.2.6。取4 mL制备好的菌悬液（A600=1.0）置于10 mL带刻度的螺口试管中，室温静置分层，分别在静置1、2、3、4、5 h后吸取1 mL上层悬液测A600值，分别记作A1、A2、A3、A4、A5，每个菌株每个时间点平行做3管重复。细菌自凝聚率（AA）计算：

式（2）中：C即AA，A0和At分别是自凝聚前后上层悬液在600 nm下测量所得的A值。

1.2.8菌株对Caco-2细胞的粘附能力测定采有Caco-2细胞作为体外模型测试菌株的粘附能力。Caco-2细胞用添加体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青链双抗的DMEM培养液培养，细胞于体积分数5%CO2培养箱中37℃培养，2 d换液一次。细胞用质量分数0.25%胰酶消化并转移到24孔细胞培养板中，于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养至单层细胞形成。戊糖片球菌用MRS活化两代，离心收集菌体，PBS洗2次，用不含胎牛血清和抗生素的DMEM培养液重悬菌体。倾去Caco-2细胞培养板中的培养液，用无菌PBS冲洗2次，然后加入0.5 mL菌悬液，培养1 h后用无菌PBS洗涤4次，洗去未粘附的菌体，加入1 mL Triton 100（体积分数1%），使粘附的菌体同细胞分离，吹打混匀，梯度稀释平板法测定粘附细菌数。用细菌数与阴性对照孔中的细胞数的比值（cfu/cell）表示菌株对Caco-2细胞的粘附能力。

1.2.9菌株对小肠黏液的粘附能力测定参照文献［15］方法制备小肠黏液，将6周龄ICR小鼠固定24 h后解剖，取小肠置于冰面，用无菌PBS（pH 7.2，0.01 mol/L）冲洗小肠3次后纵向剪开，刮取小肠内表面黏液，加入2倍体积的PBS缓冲液，混匀，然后12 000 r/min、4℃离心10 min，收集上清液，用考马斯亮蓝法测定黏液蛋白质质量浓度，分装后-20℃保存备用。取1.0 mL不同浓度的戊糖片球菌悬液于离心管中，10 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入1.0 mL质量分数0.1%结晶紫溶液染色50 min后离心收集菌体，PBS洗涤5次后加入1.0 mL柠檬酸盐缓冲液重悬，室温放置60 min后测定A540，建立A540和菌悬液细胞数的标准曲线。再参考Vesterlund等建立的方法［16］测定菌株对小肠黏液的粘附能力。取96孔板，每孔加入100 μL鼠小肠黏膜提取液（蛋白质2.0 mg/mL），4℃过夜固定。每孔加入100 μL菌悬液，4℃孵育2 h倾去悬液并用PBS缓冲液洗涤4次，除去未粘附的细菌。将96孔板置于60℃烘箱30 min。每孔加入100 μL质量分数0.1%结晶紫溶液染色50 min，250 μL PBS洗涤5次，加入100 μL柠檬酸盐缓冲液（pH 4.3，0.02 mol/L），室温放置60 min后测定A540，并根据建立的标准曲线计算多孔板中粘附的细菌数量，以粘附细菌数和加入细菌数的百分数表示菌株的粘附能力。

1.2.10数据分析菌株表面疏水率、自凝聚率以及粘附指数试验结果取3次试验的平均值，以平均值±标准差表示，菌株间差异及数据间的相关性采用Sigmaplot 10.0软件中的t检验和线性回归模式进行统计分析，以P＜0.05为有统计学意义。

2　结果与分析

2.1戊糖片球菌分离鉴定结果

通过改良MRS平板分离和厌氧培养在采集的不同来源的臭豆腐发酵卤水样品中均分离得到大量革兰氏阳性、接触酶阴性的产酸菌株，其中菌株F28-8、Y45-30、F3、Y27-4、H13、H6和H10的细胞形态呈二联或四联球状的分离株，如图1（a）所示，扫描电镜结果显示分离株的细胞形态以四联球为主，并且成片聚集在一起，如图1（b）所示。这7个菌株具有相同的生理生化特征，实验结果如表1所示，根据伯杰细菌手册［17］及常见细菌系统鉴定手册［12］描述，这7株球菌菌株均具有典型的戊糖片球菌的生理生化特征。进一步提取7个球菌分离株的基因组DNA并进行16S rDNA扩增，扩增产物和预期大小一致（1 500 bp左右）。将扩增产物测序结果在基因库GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中进行Blasten比对，结果如表2所示，序列同源性相似性最高的均为戊糖片球菌（最大同源性＞99%），只是不同的菌株在GenBank中相似度最高的菌株有所不同。因此，这7个分离株均属于戊糖片球菌种，但可能属不同的基因型。

图1　戊糖片球菌分离株的细胞形态Fig.1　Cell morphology of Pediococcus pentosaceus strains

表1　戊糖片球菌分离株的生理生化鉴定结果Table 1　Resultsofphysiologicalandbiochemical characteristicsofPediococcuspentosaceus strains

表2　戊糖片球菌分离株16S rDNA测序鉴定结果Table 2　Sequencing results of 16S rDNA identification of Pediococcus pentosaceus strains

2.2戊糖片球菌的菌株分子多样性

应用RAPD分子分型方法对7株戊糖片球菌分离株的基因型进行分析，两种不同随机引物M13和M14的扩增谱带模式如图2所示。M13扩增得到2个不同的指纹图谱（A型和B型），M14扩增得到5个不同的指纹图谱，分别为1型、2型、3型、4型和5型。将两种谱带模式进行组合分型，获得了6种基因型，表明发酵卤水中的戊糖片球菌存在高度的分子多样性，其中H6为A1型，H10为B2型，H13为B3型，F3为A4型，Y45-30为A6型，菌株F28-8和Y27-4谱型相同均为A5型。将菌株的特征指纹图谱中的扩增条带按“有”和“无”进行数字化处理，应用Nei氏遗传距离和类平均法进行聚类分析，结果显示在Nei氏遗传距离为0.30处，可以分成4簇，其中第1簇包含菌株H6、F28-8、Y27-4和Y45-30，显示了这4个菌株具有较为相似的基因型，而F3、H10和H13各自形成一簇，表明菌株间基因型具有较大的差异性。

2.3不同戊糖片球菌菌株细胞表面特性及粘附能力测定结果

7株不同戊糖片球菌细胞表面特性及粘附能力测定结果如图3所示。MATH法测定表面疏水率结果显示7株戊糖片球菌的表面疏水性存在高度的菌株差异性，如图3（a）所示，不同菌株的表面疏水率大小介于12.7%～97.1%，其中3个基因型高度相似的菌株F28-8、Y27-4和Y45-30显示了高度疏水性，疏水率分别为96.5%，97.1%和93.6%。而菌株F3和H13的疏水率为12.7%和24.2%，显著低于其它菌株（P﹤0.01），为弱疏水性菌株。应用分光光度法对7株戊糖片球菌在涡旋后静置1～5 h的自凝聚性进行测定，结果如图3（b）所示。结果显示，菌株悬液涡旋振荡以后随着静置时间的延长自凝聚率逐渐增大，菌株间的自凝聚率具有显著差异，其中菌株F28-8、Y27-7在2 h后的各个时间点的凝聚率均显著高于其它菌株（P＜0.01），显示了较高的自凝聚能力。而菌株F3和H13显示了较弱的自凝聚能力。应用Caco-2细胞作为模型研究了7株戊糖片球菌对肠上皮细胞的粘附性，结果如图3（c）所示。结果表明，不同菌株的Caco-2细胞粘附率在12.8～57.4 cfu/cell之间，其中高疏水性菌株F28-8、Y27-4和Y45-30具有较高的粘附性，细胞粘附率分别为57.4、46.5 cfu/cell和51.7 cfu/cell，而弱疏水性菌株F3和H13细胞粘附率分别为12.8、10.6 cfu/ cell，显示了相对较低的细胞粘附性。通过提取小鼠的肠黏液蛋白质建立体外模型测定了7株戊糖片球菌对肠黏液的粘附率，结果如图3（d）所示。不同菌株对肠黏液蛋白质显示了不同的粘附率，其中菌株F28-8和Y45-30显示了较高的粘附性，分别为35.2%和25.8%，显著高于其它菌株（P＜0.01），菌株H13、H6和H10的粘附率分别为9.7%、5.7%和4.3%，显示了相对较低的粘附性。

图2　不同戊糖片球菌分离株的RAPD指纹图谱及聚类分析Fig.2　RAPD fingerprinting and clustering analysis of different Pediococcus pentosaceus strains

图3　不同戊糖片球菌表面疏水性、自凝聚能力以及对Caco-2细胞和肠黏膜蛋白质的粘附能力比较Fig.3　Comparison of surface hydrophobicity，autoaggregation ability，and adhesion ability to Caco-2 cell andintestinalmucusofdifferentPediococcus pentosaceus strains

2.4相关性分析结果

将不同戊糖片球菌菌株的Caco-2细胞粘附率、黏液蛋白质粘附率、表面疏水率和自凝聚率（2 h）数据两两组合进行统计分析，绘制相关性散点图（如图4（a）—（f）所示），并用线性模型模拟它们之间的关系。结果表明戊糖片球菌不同菌株对Caco-2细胞粘附性和肠黏液蛋白质的粘附率呈显著正相关（r=0.763，P=0.046，图4（f）），可能Caco-2细胞和肠黏液蛋白质中存在共同的戊糖片球菌粘附素受体。菌株的表面疏水率和自凝聚率（2 h）与Caco-2细胞粘附率呈显著正相关（r=0.900和0.792，P＜0.05，图4（a）（d）），但是与肠黏液蛋白质粘附率相关性不显著（r=0.426和0.700，P＞0.05，图4（b）（e）），可能原因是戊糖片球菌在与Caco-2细胞粘附中表面疏水性和自凝聚能力等非特异粘附发挥了主要作用，而在肠黏液蛋白质作用体系中“粘附素-受体”特异性粘附起主要作用，表面疏水性和自凝聚能力影响较小。疏水性与自凝聚的相关性分析结果显示，两者呈正相关趋势（r=0.727），但不显著（P= 0.064，图4（c）），疏水性是细菌发生自凝聚的主要驱动力，但是受多种因素的影响，如细菌表面组分和结构等，但是总体看来疏水性较高的菌株如F28-8和Y27-4自凝聚率也相对较高。

图4　戊糖片球菌细胞表面特性与粘附能力的相关性分析Fig.4　Correlation analysis between cell surface characteristics and adhesion abilities of Pediococcus pentosaceus strains

3　讨论

由于抗生素在人类疾病治疗和动物饲养中的大量使用，导致环境中抗生素的积累和耐药性菌株的不断出现，对环境和食品安全带来了威胁。微生态制剂因其能够改善胃肠道功能、提高动物免疫力，在疾病预防和动物饲养中得到了大量推广和应用。戊糖片球菌由于其独特的抗菌性能和免疫调节功能而具有良好应用前景［4-5，18-19］。目前普遍认为粘附能力是益生菌发挥生理作用的前提，也是决定这种益生菌制剂实际效果的重要因素［20］。本课题研究中从臭豆腐发酵卤水中分离鉴定了7株戊糖片球菌，DNA指纹图谱显示具有高度的种内分子多样性。应用Caco-2细胞系和固定化肠黏液蛋白质两种体外模型评价了7株戊糖片球菌分离株的粘附性，结果显示特征指纹图谱为A5型的两个菌株（F28-8和Y27-4）显示了最高的Caco-2细胞和肠黏液蛋白质粘附能力。

应用Caco-2细胞系和固定化肠黏液蛋白质模型评价菌株的黏附能力涉及到细胞培养和动物解剖试验，操作复杂且耗费昂贵。应用分光光度法测定细菌自凝聚能力和微生物粘着碳氢化合物（Microbial Adhesion To Hydrocarbons，MATH）法测定疏水性，对细菌粘附性进行预测和初步筛选更为简单、廉价。本文中探讨了戊糖片球菌表面理化特性与其肠道细胞和黏液粘附的相关性，研究结果显示，戊糖片球菌的表面疏水性和自聚集能力存在显著菌株差异性，其中指纹图谱最相近的3个菌株F28-8（A5型）、Y27-4（A5型）和Y45-30（A6型）显示了高度疏水性（＞90%）。本研究中戊糖片球菌的表面疏水率和自凝聚率（2 h）与Caco-2细胞粘附率呈显著正相关（P＜0.05），与前期报道中对Bifidobacterium longum菌株的研究结果［21］一致，表明菌株的表面疏水性和自凝聚性在Caco-2细胞粘附过程中发挥了重要作用。尽管有研究表明乳酸菌的一些菌株在体外对Caco-2细胞粘附性和肠黏液粘附能力并不一致［22］，但本研究中戊糖片球菌对Caco-2细胞和固定化肠黏液的粘附率却呈显著正相关（P＜0.05），这可能是戊糖片球菌对这两种基质的粘附存在共同的作用机制和影响因素。但是表面疏水率和自凝聚率与肠黏液蛋白质粘附率相关性不显著（P＞0.05），可能原因是戊糖片球菌在固定化肠黏液蛋白质作用体系中“粘附素-受体”特异性粘附起了主要作用［23］，表面疏水性和自凝聚能力引起的非特异粘附影响较小。

4　结语

本研究结果为建立体外筛选高粘附性戊糖片球菌菌株提供了实验依据，并为进一步体内研究戊糖片球菌功能特性提供了候选菌株。也为开发戊糖片球菌生态制剂提供了候选菌株，同时为深入研究戊糖片球菌在动物体内的定植和动态变化提供了分子追踪方法。对从大量菌株中筛选高粘附性菌株，缩小试验范围、节约测试成本具有重要意义［9，11］。

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Screening and Molecular Marking of Highly Adhesive Pediococcus pentosaceus and the Characteristics of Their Surface Hydrophobicities and Autoaggregation Abilities

YANG Zhenquan1，2，JIN Caijuan1，ZHANG Mi1，WANG Xiaolin1，GAO Lu1，GU Ruixia1，2
（1.College of Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou225127，China；2.Jiangsu Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Safety Control，Yangzhou 225127，China）

Seven strains of Pediococcus pentosaceus were isolated and identified from the fermented stinky tofu brine using methods of conventional bacteria isolation combined with physiological and biochemical test and 16S rDNA sequencing identification.The specific fingerprint for each strain was developed by the random amplified polymorphic DNA（RAPD）technique.The adhesive ability of the strain and the correlation of phenotypic characteristics of strain adhesion and genotype，surface hydrophobicity，and aggregation ability were studied using Caco-2 cell and intestinal mucus proteinas in vitro model.Results showed that six different fingerprint patterns were found in the seven Pediococcus pentosaceus strains，among them，the A5 subtype of strains（F28-8 and Y27-4）showed the strongest adhesion to the Caco-2 cells and intestinal mucus.Furthermore，these two strains also exhibited highly hydrophobic（the hydrophobicity rate＞90%）and higher aggregation ability（the aggregation rate at 2 h＞5%）.Correlation analysis results showed that the surface hydrophobicity and aggregation ability of Pediococcus pentosaceus were positively related to the adhesive ability to the Caco-2 cell significantly（r=0.900 and 0.792，P＜0.05），but they were not significantly correlated to the adhesive ability to the intestinal mucus（r=0.426 and 0.700，P＞0.05）.The results of this study provide the basis for establishing techniques of rapid screening highly adhesive Pediococcus pentosaceus strains and their colonization and distribution in vivo.

Pediococcuspentosaceus，adhesion，surface hydrophobicity，autoaggregation ability，DNA fingerprint

TS 254

A

1673—1689（2015）09—0926—09

2014-09-30

国家自然科学基金项目（31371806）；江苏省重点实验室开放课题；江苏省青蓝工程资助项目。

杨振泉（1975—），男，江苏南通人，农学博士，副教授，主要从事食品微生物资源开发与利用研究。E-mail：yangzq@yzu.edu.cn