Box-Behnken响应面设计法优化微波辅助提取猪苓多糖工艺

乔艳明，陈文强*，2，邓百万，2，彭浩，2，解修超，2，张辉，潘嘉伟

（1.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723000；2.陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西汉中723000；3.陕西省南郑中学，陕西南郑723100）

Box-Behnken响应面设计法优化微波辅助提取猪苓多糖工艺

乔艳明1，陈文强*1，2，邓百万1，2，彭浩1，2，解修超1，2，张辉3，潘嘉伟3

（1.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723000；2.陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西汉中723000；3.陕西省南郑中学，陕西南郑723100）

为了优化猪苓多糖的微波提取工艺，采用Box-Behnken响应面设计法，研究液料比、pH、微波功率、提取时间、提取次数及其交互作用对多糖提取率的影响。应用Design Expert和响应面分析相结合的方法，模拟得到回归方程的预测模型和可信度，分析得到最佳提取工艺条件为：液料比30∶1（mL/g），pH 6.6，微波功率614 W，提取时间2.5 min，提取次数2次。在此条件下，多糖提取率达到6.75%。利用Box-Behnken响应面设计法优化得到的猪苓多糖提取条件参数，为猪苓多糖工业化生产提供技术支持。

猪苓；微波辅助提取；多糖；Box-Behnken设计；响应面分析

猪苓（Polyporus umbellatus），俗称猪屎苓、野猪粪等。属真菌门、担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、猪苓（地花）属。猪苓主要分布于河北、陕西、四川等地［1］，其菌核含麦角甾醇、粗蛋白质、可溶性糖分、多糖及X-羟基二十四碳酸等成分［2-3］。现代药理学研究表明，猪苓提取物中多糖成分具有抗氧化［4］、增强免疫功能［5］和保护肝脏［6］等作用，临床应用也取得了较好疗效。

近年来，真菌多糖的提取技术已由传统的溶剂提取法逐渐转向运用超声波［7-8］和微波辅助提取［9-10］新技术。与传统方法相比，微波辅助提取真菌多糖具有速度快、选择性高、提取率高、溶剂消耗少、操作简便等特点［11-13］，同时可以防止提取物在长时间、高温条件下发生降解和褪色。响应面法（Response Surface Methodology，RSM）是可通过回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题，具有周期短、精度高、实用价值高等特点，已广泛应用于化学工业、生物学、食品学、工程学等领域，在真菌多糖微波辅助提取条件优化研究中也取得了良好效果［14］。2011年，曾维才［15］等采用响应面法优化微波辅助提取黑木耳多糖工艺，黑木耳多糖提取率可达16.53%；2012年，Zhao［16］等用响应面分析法优化微波辅助提取梭柄松苞菇多糖，梭柄松苞菇多糖提取率为（7.83±0.19）%；2012年，Chen［17］等用响应面法优化微波辅助提取银耳多糖，银耳多糖提取率为（65.07±0.99）%；2013年，杨开［18］等用响应面法优化了微波辅助提取松木层孔菌多糖，松木层孔菌多糖提取率为3.88%；2014年，岳春［19］等用响应面法优化了微波辅助提取虫草多糖，虫草多糖提取率为12.1%。

目前，响应面法用于优化微波辅助提取猪苓多糖的工艺尚未见研究报道，本研究中采用微波辅助提取猪苓多糖，并通过响应面分析法优化提取工艺，借助Design Expert软件，采用Box-Behnken模式对各主要影响因素之间的单一和交互作用等进行了研究，得出最佳提取工艺参数，为从猪苓菌核中提取多糖的工业化生产提供了理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料猪苓菌核由陕西天美绿色产业有限公司提供。

1.1.2主要试剂无水乙醇、葡萄糖、苯酚、硫酸、氯仿等均为分析纯，试验用水为纯化水。

1.1.3主要仪器723N型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司制造；FW177型高速万能粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂制造；101A-1型鼓风干燥箱，上海试验仪器总厂制造；RV10基本型V旋转蒸发仪，广州仪科试验室技术有限公司制造；WD700型微波炉，乐金电子电器有限公司制造；WF-2000型微波快速反应系统，上海屹尧分析仪器有限公司制造；BSA8201型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司制造；PHS-3C型精密酸度计，上海大普仪器有限公司制造。

1.2方法

1.2.1材料预处理将新鲜猪苓菌核除杂，60℃烘干至恒质量，24 000 r/min粉碎1 min，40目过筛，备用。

1.2.2微波提取方法精确称取猪苓粉末5.0 g，按照一定的液料比加入纯化水，调节pH，在一定的微波功率下提取一定时间，抽滤，按照此法提取若干次，合并滤液真空浓缩，室温下定容至200 mL。

1.2.3多糖的测定方法苯酚-硫酸法［20］。

1.2.4单因素试验按照1.2.2提取步骤，研究提取次数、液料比、pH、微波功率、提取时间5个因素对猪苓多糖提取率的影响。

1）提取次数试验：准确称取猪苓粉末5.0 g，分别选择不同提取次数，其他条件不变，进行单因素试验。

2）液料比试验：准确称取猪苓粉末5.0 g，分别选择不同液料比，其他条件不变，进行单因素试验。

3）pH试验：准确称取猪苓粉末5.0 g，分别选择不同pH，其他条件不变，进行单因素试验。

4）微波功率试验：准确称取猪苓粉末5.0 g，分别选择不同微波功率，其他条件不变，进行单因素试验。

5）提取时间试验：准确称取猪苓粉末5.0 g，分别选择不同提取时间，其他条件不变，进行单因素试验。

1.2.5微波提取最佳工艺的响应面法优化在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，选取液料比（X1）、pH（X2）、微波功率（X3）、提取时间（X4）、提取次数（X5）为考察对象，以猪苓多糖提取率（Y）为响应值，采用5因素3水平响应面分析法确定最佳提取工艺条件。试验因素水平编码见表1。

表1　5因素3水平试验设计Table 1　Experiment design of 5 factors and 3 levels

2　结果与分析

2.1微波辅助提取猪苓多糖的单因素试验

2.1.1提取次数对多糖提取率的影响准确称取猪苓粉末5.0 g，在液料比25∶1（mL/g）、pH 6.5、微波功率420 W、提取时间3 min的条件下，研究不同提取次数（1，2，3，4次）对多糖提取率的影响，结果见图1。

图1　提取次数对多糖提取率的影响Fig.1　Effect of extraction number on extraction rate of polysaccharide

图1结果表明，随着提取次数的增加，多糖提取率也逐渐增大。当提取2次时，提取率为5.06%。当提取次数大于2次时，多糖提取率增加缓慢，基本趋于稳定。增加提取次数，会增加提取成本，同时会造成溶剂和能源的浪费。综合考虑提取效果和经济节约等因素，因此，选择微波提取猪苓多糖的提取次数为2次。

2.1.2液料比对多糖提取率的影响准确称取猪苓粉末5.0 g，在pH 6.5、微波功率420 W、提取时间3 min、提取次数2次的条件下，研究不同液料比15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1（mL/g）对多糖提取率的影响，结果见图2。

图2　液料比对多糖提取率的影响Fig.2　Effect of the ratio of liquid to solid on extraction rate of polysaccharide

图2结果表明，猪苓多糖提取率随着液料比的增大呈现先增大后减小的趋势，在液料比为30∶1（mL/g）时达到最大，提取率为5.08%。因此，选择微波提取猪苓多糖的液料比为30∶1（mL/g）。

2.1.3pH对多糖提取率的影响准确称取猪苓粉末5.0 g，在液料比30∶1（mL/g）、微波功率420 W、提取时间3 min、提取次数2次的条件下，研究不同pH（5.5，6.0，6.5，7.0，7.5）对多糖提取率的影响，结果见图3。

图3　pH对多糖提取率的影响Fig.3　Effect of pH on extraction rate of polysaccharide

图3结果表明，多糖提取率在pH为6.5时达到最大，提取率为5.81%，增大或减小pH均会导致多糖提取率降低。因此，选择微波提取猪苓多糖的pH为6.5。

2.1.4微波功率对多糖提取率的影响准确称取猪苓粉末5.0 g，在液料比30∶1（mL/g）、pH 6.5、提取时间3 min、提取次数2次的条件下，研究不同微波功率（140，280，420，560，700 W）对多糖提取率的影响，结果见图4。

图4　微波功率对多糖提取率的影响Fig.4　Effect of microwave power on extraction rate of polysaccharide

图4结果表明，多糖提取率随着微波功率的增大呈现先增加后减小的趋势，在微波功率为560 W时达到最大，提取率为6.39%。因此，选择微波提取猪苓多糖的微波功率为560 W。

2.1.5提取时间对多糖提取率的影响准确称取猪苓粉末5.0 g，在液料比30∶1（mL/g）、pH 6.5、微波功率560 W、提取次数2次的条件下，研究不同提取时间（1、2、3、4、5 min）对多糖提取率的影响，结果见图5。

图5　提取时间对多糖提取率的影响Fig.5　Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide

图5结果表明，多糖提取率随着提取时间的增加呈现先增加后减小的趋势，在提取时间为2 min时达到最大，提取率为6.48%。因此，选择微波提取猪苓多糖的提取时间为2 min。

2.2Box-Behnken设计优化主要影响因素水平

采用5因素3水平响应面分析法进行研究，考虑各因素间的交互作用以及各因素对多糖提取率的影响。试验结果见表2。

表2　Box-Behnken设计和试验结果Table 2　Box-Behnken design and experimental result

续表2

经Design Expert软件对46个试验点的多糖提取率进行回归统计分析，得出二次模型回归统计分析表（表3）。

多糖提取率的回归方程如下：

表3　回归分析结果Table 3　Result of regression analysis

表3结果表明，X2、X2X4、X3X4、X3X54项显著；X1、X3、X4、X5、X2X3、X12、X22、X32、X42、X5210项极显著，其他X1X2、X1X3、X1X4、X1X5、X2X5、X4X5不显著。模型P值小于0.000 1，可信度水平大于99.99%，说明该模型有意义。回归模型的R2=0.983 4，R2Adj=0.970 2，说明多糖提取率的试验值和预测值之间具有良好的拟合度。该模型失拟项P值为0.610 3＞0.05，失拟项差异不显著，说明试验操作可信，试验理论可使用。另外从F值可看出单因素对多糖提取率的影响顺序：X4＞X5＞X3＞X1＞X2，即影响顺序依次为：提取时间＞提取次数＞微波功率＞液料比＞pH。

2.3响应面及最佳优化条件的验证

根据回归方程绘制多糖提取率随各因素变化的响应曲面图。由响应曲面图可知，液料比、pH、微波功率、提取时间、提取次数5个因素对多糖提取率的影响（图6—15）。每个响应曲面分别代表着两个独立因素间的相互作用，其余两个因素保持在编码水平的0水平。

由图6—9可知，液料比与其它各因素之间的交互作用对多糖提取率的影响均不显著。

图6　Y=f（X1，X2）响应曲面Fig.6　Response surface of Y=f（X1，X2）

图7　Y=f（X1，X3）响应曲面Fig.7　Response surface of Y=f（X1，X3）

图8　Y=f（X1，X4）响应曲面Fig.8　Response surface of Y=f（X1，X4）

图9　Y=f（X1，X5）响应曲面Fig.9　Response surface of Y=f（X1，X5）

由图10可知，微波功率和pH的交互作用十分显著；在低微波功率条件下随着pH的增大，多糖提取率会逐渐升高，最后趋于平稳；而在高微波功率条件下，随着pH的增大，多糖提取率会先缓慢升高然后迅速下降。

图10　Y=f（X2，X3）响应曲面Fig.10　Response surface of Y=f（X2，X3）

由图11可知，pH和提取时间的交互作用显著；在一定pH条件下，随着提取时间的增加，多糖提取率会迅速升高至平稳，然后略有下降。

图11　Y=f（X2，X4）响应曲面Fig.11　Response surface of Y=f（X2，X4）

由图12可知，提取次数和pH的交互作用不显著。

图12　Y=f（X2，X5）响应曲面Fig.12　Response surface of Y=f（X2，X5）

由图13可知，微波功率和提取时间的交互作用显著；在低微波功率条件下，多糖提取率会随着提取时间的延长，先升高至平稳，后略有下降；在高微波功率条件下，随着提取时间的延长，起初升高较快，后来比较缓慢，逐渐趋于平稳。

图13　Y=f（X3，X4）响应曲面Fig.13　Response surface of Y=f（X3，X4）

由图14可知，微波功率和提取次数的交互作用显著；在一定的微波功率条件下，随着提取次数增加和微波功率的增大，多糖提取率都是起始升高较快，最后趋于平稳。

图14　Y=f（X3，X5）响应曲面Fig.14　Response surface of Y=f（X3，X5）

由图15可知，提取时间和提取次数的交互作用不显著；按照一定的提取次数，随着提取时间的增加，多糖提取率起始升高较快，最后趋于平稳。

图15　Y=f（X4，X5）响应曲面Fig.15　Response surface of Y=f（X4，X5）

综上所述，由回归模型得到影响猪苓多糖提取率的各因素最优值为液料比30∶1（mL/g），pH 6.6，微波功率614 W，提取时间2.5 min，提取次数2次，此时猪苓多糖提取率的最大预测值为6.68%。为了检验该最佳提取工艺的可靠性，采用上述最优提取条件进行验证试验，得到多糖提取率的验证值为6.75%。由于多糖提取率的验证值与最大估计预测值非常接近，因此，利用Box-Behnken响应面法优化微波辅助提取猪苓多糖的工艺是有效可行的。

3　结语

通过单因素和Box-Behnken响应面试验得到微波辅助提取猪苓多糖的最佳工艺条件为：液料比30∶1（mL/g），pH 6.6，微波功率614 W，提取时间2.5 min，提取次数2次。在此工艺条件下，获得猪苓多糖的提取率为6.75%。

近年来，利用微波辅助提取猪苓多糖的研究报道甚少。2012年，李志洲［21］用二次回归正交试验优化微波辅助提取猪苓多糖工艺，提取率仅2.86%；2012年，孙缨［22］等用正交试验优化微波辅助提取猪苓多糖工艺，提取率为3.663%。

与李、孙的研究相比，本研究中采用Box-Behnken响应面法优化微波辅助提取猪苓多糖的工艺，其提取率显著高于现有文献报道。一方面由于多糖检测方法（苯酚-硫酸法）的稳定性和准确性较好［23］；另一方面是基于响应面法可在更广泛的范围内考虑因素的组合，预测响应值，比其他分析方法更为高效［14］。利用Box-Behnken响应面法优化得到的猪苓多糖提取工艺参数准确可靠，可为猪苓多糖的工业化生产提供必要的技术支持。

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Microwave-Assisted Extraction of Polysaccharides from Polyporus umbellatus Optimized by Box-Behnken Design-Response Surface Methodology

QIAO Yanming1，CHEN Wenqiang1，2，DENG Baiwan1，2，PENG Hao1，2，XIE Xiuchao1，2，ZHANG Hui3，PAN Jiawei3
（1.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China；2. Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi，Hanzhong 723000，China；3.Nanzheng Middle School of Shaanxi，Nanzheng 723100，China）

To optimize the microwave-assisted extraction technique of polysaccharide from Polyporus umbellatus，the effects of the liquid to solid ratio，pH，microwave power，extraction time，extraction number and their interaction on extaction were studied by Box-Behnken design.The predictive model and reliability were developed by Design Expert software and response surface analysis（RSM）.The optimal extraction conditions were achieved and listed as follows：liquid-to-solid ratio 30∶1 mL/g，pH 6.6，microwave power 614 W，extraction time 2.5 mins，extraction number 3 times.Under these conditions，the extraction yield of polysaccharide was up to 6.75%.The extraction conditions achieved by RSM provided technical support for the industrialproduction of polysaccharide from Polyporus umbellatus.

Polyporusumbellatus，microwave-assisted extraction，polysaccharides，Box-Behnken design，response surface analysis

Q 949.329.7

A

1673—1689（2015）09—0986—09

2014-10-07

陕西省“春笋计划”研究项目（2014-2015）。

陈文强（1956—），男，陕西洋县人，教授，硕士研究生导师，主要从事微生物资源的保护与利用研究。E-mail：wenqiangc@126.com