猪PILRB基因的克隆及多态性分析
2015-11-11
猪PILRB基因的克隆及多态性分析
杨秀芹，邵思宇，李利族，王秋实，牛艳春，张姣
（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨150030）
摘要：Ⅱ型配对免疫球蛋白样受体（Paired immunoglobulin-like type 2 receptors，PILRs）是近年发现的免疫球蛋白超家族成员之一，含有两个亚型，PILRα和PILRβ。在机体天然免疫反应中发挥重要作用，目前猪PILRB基因基因组序列尚未得到克隆、测序。研究利用PCR方法克隆猪PILRB基因部分基因组序列并分析该区域多态性。结果表明，获得猪PILRB基因序列长1 127 bp，包含完整外显子1、内含子1、外显子2、内含子2、外显子3和部分内含子3。猪PILRB基因内含子1和内含子2为研究首次克隆，全长分别为9和314 bp。在该区域共检测到15个SNPs，其中6个为中度多态位点，共形成5种单倍体型，ACACCG为优势单倍体型。研究结果为进一步揭示这些SNPs对PILRβ功能的影响及其在猪抗病育种中的作用提供基础。
关键词：猪；PILRB基因；克隆；SNPs
网络出版时间2015-1-12 9:53:57
[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150112.0953.012.html
杨秀芹,邵思宇,李利族,等.猪PILRB基因的克隆及多态性分析[J].东北农业大学学报, 2015, 46(1): 68-73.
Ⅱ型配对免疫球蛋白样受体（Paired immuno⁃globulin-like type 2 receptors，PILRs）是免疫球蛋白超家族成员之一，包括α和β两个亚型。PILRα是免疫抑制性受体，PILRβ是免疫激活性受体，二者在胞外区高度同源，都含有一个免疫球蛋白样V型结构域，负责与配体结合。在胞内区，PILRα含有两个酪氨酸残基免疫受体抑制性基序（Immunore⁃ceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM），可释放抑制性信号[1]；PILRβ胞内区较短，不含有ITIM，能够与含有酪氨酸残基免疫受体激活性基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif , ITAM）的接头分子相结合，释放激活性信号[2]。
PILRα和PILRβ两种受体通过传递重要的对立信号参与维持机体的免疫系统稳定，在宿主免疫调控中发挥重要作用[3]。PILRs还与病毒入侵、疾病发生有关。人I型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus 1, HSV1）通过包膜糖蛋白B（Glycoprotein B, gB）与PILRα相互作用侵入宿主细胞，gB基因突变导致病毒无法以PILRα依赖的方式入侵，机体疾病症状减轻[4-5]。本文利用高通量测序技术在猪呼吸道上皮细胞内筛选猪抗病毒候选基因时，发现有一个tag的表达受到病毒类似物——poly（IϑC）显著诱导，生物信息学分析发现该tag对应于猪PILRB基因。
目前，GenBank上提供的猪PILRB基因序列尚不完整，有关猪PILRβ的研究尚未见报道。本研究以大白猪、民猪、北京黑猪为试验材料，克隆猪PILRB基因的部分基因组序列；采用PCR产物直接测序方法在所扩增区域内寻找SNPs，分析各SNPs在群体中的分布规律；并通过生物信息学方法预测SNPs对猪PILRβ配体识别、信号传递的影响，研究结果可为猪PILRβ功能的揭示提供序列基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物及基因组DNA提取
大白猪、民猪、北京黑猪均来自黑龙江省农业科学院畜牧研究所猪场。采集耳组织样放在装有75%酒精的EP管中，常温带回实验室。采用酚-氯仿法提取基因组DNA。
1.1.2主要药品及试剂盒
限制性内切酶、rTaq酶、dNTPs、DNA Marker、pMD18-T载体均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒（小量）抽提试剂盒购自天根生物科技有限公司；胶回收（小量）试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖为西班牙原装进口；酵母提取物、胰蛋白胨购自OXOID公司；氨苄青霉素试剂购自Amresco公司；其他常规化学试剂均由东北农业大学动物遗传育种与繁殖实验室保存。
1.2引物设计与合成
以GenBank中提供的猪PILRB mRNA序列（JQ890108.2）为探针，在UCSC数据库中进行Blat，并参考人PILRB基因结构，确定猪PILRB基因结构及外显子/内含子边界。利用Primer premier 5.0软件设计引物，扩增猪PILRB部分基因组序列。引物序列如下：
上游：5' GCAAGACTGATAAAGGAAGTGAC GG 3'；
下游：5' AAAAGCGGAAGGTTGGCGG 3'
上游引物位于起始密码子上游198 bp处，下游引物位于内含子3的144 bp处。
1.3 PILRB基因组序列的克隆
以北京黑猪基因组DNA为模板，利用所设计引物对PILRB基因进行克隆。PCR总反应体系为25 μL，含有2.5 μL 10×PCR buffer，0.5 μL dNTPs （2.5 mmol·L-1each），上、下游引物各0.5 μL（10 pmol·L-1），rTaq酶0.25 μL，DNA 50 ng。PCR扩增条件：95℃5 min；94℃30 s，61.5℃30 s，72℃90 s，35个循环；72℃5 min。扩增产物胶回收纯化后，连接pMD18-T载体，转化DH5a感受态细胞，筛选阳性菌落送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
1.4猪PILRB基因多态性分析
分别以大白猪（10头）、民猪（13头）每个个体基因组DNA为模板，扩增PILRB基因组序列，反应体系和反应条件同上。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，利用PCR产物直接测序方法寻找多态位点。
1.5数据分析
利用DNAMAN软件对测序结果进行序列比对和SNP位点查找，利用Chromas软件肉眼观察测序峰图，确定SNP位点是否为杂合。利用Popgene软件计算等位基因频率、基因型频率、多态信息含量（Polymorphism information content, PIC）等统计参数值；利用SHEsis在线软件（http://analysis.bio-x. cn/myAnalysis.php）分析连锁不平衡程度；利用PHASE V2.1软件进行单倍体型分析。
2 结果与分析
2.1猪PILRB基因组部分序列分析
利用设计引物获得特异性较好的PCR产物，大小和理论预期一致（见图1）。PCR产物经克隆、测序和序列拼接后，获得1 127 bp序列，包括PIL⁃RB基因完整外显子1、内含子1、外显子2、内含子2和部分内含子3序列（见图2）。
图1 猪PILRB基因组部分序列扩增结果Fig. 1 Amplification result of partial genomicsequence of PILRBgene in porcine
2.2猪PILRB基因多态性分析
采用PCR产物直接测序方法分析10头大白猪、13头民猪PILRB基因多态性，在所扩增区域共检测到15个SNPs，为更好地解释15个SNPs多态意义，对23头猪的SNPs进行多态信息含量统计，结果见表1。其中6个SNPs位点在试验群体中多态信息含量呈中度多态（0.25 2.2.1 SNPs鉴定 采用PCR产物直接测序方法分析10头大白猪、13头民猪PILRB基因多态性，在所扩增区域共检测到15个SNPs，其中3个位于5'调控区、5个位于内含子2、7个位于编码区（Coding sequences, CDS）。4个SNPs是错义突变，导致多肽链氨基酸的改变（见表1）。 2.2.2基因型频率/基因频率分析 多态信息含量分析表明，-17A>G、I2-145C> A、I2-158A>G、c.198G>C、c.374C>T和c.445A>G为中度多态位点（0.25 图2 猪PILRB基因组序列测序结果Fig. 2 Sequencing result of PILRB genomic sequence 表1 猪PILRB基因SNPs的相关信息Table 1 Information of SNPs in porcine PILRBgene 表2 中度多态位点的基因型频率/等位基因频率Table 2 Moderately polymorphic loci genotype /allele frequencies (%) 2.2.3连锁不平衡分析 利用SHEsis在线软件对这6个中度多态位点进行等位基因连锁不平衡状态分析，发现c.198G> C、c.374C>T、c.445A>G为完全连锁不平衡（D'= 1.000，r2=1.000）。-17A>G、I2-145C>A、I2-158A> G与c.198G>C、c.374C>T、c.445A>G这6个位点也达到有意义的连锁不平衡（D'>0.679，r2>0.194）（见图3，表3）。 图3 猪PILRB基因6个位点连锁不平衡系数D'、r2图谱Fig. 3 Linkage disequilibrium coefficient D',r2map for six loci of porcine PILRB 表3 猪PILRB基因6个SNPs位点连锁不平衡系数Table 3 Linkage disequilibrium coefficient forsix SNPs loci of porcine PILRB 2.2.4单倍体型分析 运用PHASE V2.1软件对这6个位点进行单倍体型分析，发现它们构成5种单倍体型，其中ACACCG为优势单倍体型（见表4）。 表4 猪PILRB单倍体型分析Ta?ble 4 Haplotype combinations analysis of porcine PILRB gene PILRs主要在髓系抗原递呈细胞上表达，是受SHP-1磷酸化调控的含有酪氨酸残基的成对受体蛋白，在免疫细胞信号转导途径中具有重要作用。国内外对鼠和人PILR基因研究发现其参与特异性和非特异性免疫应答，并有多种变异剪接体存在。2012年，牛艳春等在猪上克隆得到PILRB基因cDNA序列，获得猪PILRB基因4个变异剪接体[6]。牛艳春还采用RT-PCR定量技术构建猪PIL⁃RB基因组织表达谱，发现PILRB基因在心脏、肝脏、脾脏、肺、肌肉、小肠、胃、肾脏8种组织中都表达，脾脏、胃和肾脏中表达量较高[6]。研究表明，在小鼠中PILRB基因在肺、肝脏和脾脏中表达量相对较高。脾脏是哺乳动物机体内最主要的免疫器官，含有大量巨噬细胞和淋巴细胞，是机体体液免疫和细胞免疫中心。研究结果暗示PILRB基因在机体免疫中发挥重要作用。 单核苷酸多态性（SNP）指在染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起DNA序列的多态性，其中一种等位基因在群体中频率不少于1%，SNP只包括碱基替换不包括碱基插入和缺失，在遗传上比较稳定[7-8]。SNP在大多数基因组中存在较高频率，人类基因组中平均约1 kb就存在1个，SNP由于具有密度高、遗传稳定、分析易于自动化等特点，因此在遗传育种领域中意义重大[9]。本研究采用分子生物学方法克隆得到猪PILRB基因部分基因组序列，首次获得猪PILRB基因完整内含子1、2和部分内含子3序列；发现6个中度多态位点（0.25< PIC<0.5）。PIC是群体内遗传变异的量度，其值高低反映群体内个体均匀度。数值高，遗传变异就大，反之，则群体内遗传变异就小。认为PIC<0.25为低度多态，0.25 SNPs能够改变受体蛋白的配体识别、信号转导能力，对蛋白功能产生重要影响。草鱼Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）3启动子区的点突变（-764G>T）与其对呼吸道肠病毒的抗性显著相关[10]，人TLR3胞外区的一个错义突变（c.1234C>T; p. P412L）导致TLR3失去配体结合能力[11]。另有研究认为免疫相关受体的配体识别区与病原微生物共同进化，产生较多SNPs位点，以便更好监测病原微生物入侵[11]。本研究在PILRB启动子区和胞外区均检测到点突变，SNPs -17A>G和c.374C>T发生的频率较高，为通过细胞水平功能研究揭示其对基因表达、配体识别、信号传递的影响，为群体水平抗病相关遗传标记筛选与确定提供基础。 本研究成功克隆猪PILRB基因内含子1、2和部分内含子3序列，采用PCR产物直接测序方法鉴定15个SNPs，并分析其中6个中度多态位点在群体中的分布规律、连锁不平衡关系和单倍体型。研究结果可为进一步揭示SNPs对蛋白功能影响提供基础。 [参考文献] [1] Lun Y Z, Chi Q, Wang X L, et al. Identification of paired immunoglovulin-like type 2 receptor alpha as hepatitis B virus DNA polymerase transactivated protein 1 interacting proteins[J]. Mol Med Rep, 2014, 9(2): 720-724. [2]Mousseau D D, Banville D, L'Abbe D, et al. PILRα, a novel im⁃ munoreceptor tyrosine-based inhibitory motif-bearing protein, re⁃cruits SHP-1 upon tyrosine phosphorylation and is paired with the truncated counterpart PILRβ[J]. J Biol Chem, 2000, 275(6): 4467-4474. [3]Kubagawa H, Burrows P D, Cooper M D. A novel pair of immuno⁃globulin-like receptors expressed by B cells and myeloid cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(10): 5261-5266. [4]Satoh T, Suenaga T, Wang J, et al. PILRα is a herpes simplex vi⁃rus-1 entry co-receptor that associates with glycoprotein B[J]. Cell, 2008, 132(6): 935-944. [5]Arii J, Wang J, Morimoto T, et al. A single-amino-acid substitu⁃tion in herpes simplex virus 1 envelope glycoprotein B at a site re⁃quired for binding to the paired immunoglobulin-like type 2 re⁃ceptor α(PILRα) abrogates PILRα-dependent viral entry and re⁃duces pathogenesis[J]. J Virol, 2010, 84(20): 10773-10783. [6]牛艳春.猪PILRB基因变异剪接体的克隆和组织表达分析[D].哈尔滨:东北农业大学, 2012: 19-30. [7]刘木根,赵寿元.单核普酸多态概述[J].生命科学, 2000, 1(6): 277-281. [8]罗怀容,施鹏,张亚平,等.单核苷酸多态性的研究技术[J].遗传, 2001, 23(5): 471-476. [9]杨秀芹,李朋,王秋实.猪TLR4基因单核苷酸多态性对转录的影响[J].东北农业大学学报, 2013, 44(3): 20-24. [10]Heng J, Su J, Huang T, et al. The polymorphism and haplotype of TLR3 gene in grass carp (Ctenopharyngodon idella) and their as⁃sociations with susceptibility/resistance to grass carp reovirus[J]. Fish Shellfish Immunol, 2011, 30(1): 45-50. [11]Yang Z, Stratton C, Francis P J, et al. Toll-like receptor 3 and geo⁃graphic atrophy in age-related macular degeneration[J]. N Engl J Med, 2008, 359(14): 1456-1463. Yang Xiuqin, Shao Siyu, Li Lizu, et al. Cloning and polymorphism analysis on porcine PILRB gene[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(1): 68-73. (in Chinese with English abstract) Cloning and polymorphism analysis on porcine PILRB gene
3 讨论与结论
/YANG Xiuqin,SHAO Siyu, LI Lizu, WANG Qiushi, NIU Yanchun, ZHANG Jiao
(School of Animal Sciences and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)
Abstract:Paired immunoglobulin-like type 2 receptors (PILRs) composed of two subtypes, PILRα and PILRβ, are members of immunoglobulin superfamily found recently. They play important roles in host innate immune responses. However, genomic sequence of porcine PILRB gene has not been cloned and sequenced as yet. This study was designed to clone and analyze polymorphisms of partial genomic sequences of porcine PILRB gene by using PCR method. The sequence obtained was 1 127 bp in length and contained the complete sequence of exon 1, intron 1, exon 2, intron 2, exon 3 and partial of intron 3. Intron 1 and intron 2 of porcine PILRB gene, 9 and 314 bp in length, respectively, were first identified experimently. Totally, 15 SNPs were identified in the region. Six SNPs were medium polymorphic loci and group into five haplotypes of which ACACCG was dominant haplotype. The results provide a basis for further analyzing the effect of these SNPs on protein function, and the role in disease-resistant breeding as well.
Key words:pig; PILRBgene; cloning; SNPs
作者简介：杨秀芹（1971-），女，教授，博士，博士生导师，研究方向为猪分子遗传与育种。E-mail: xiuqin163@163.com
基金项目：国家自然科学基金项目（31072007）；黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12541014）
收稿日期：2014-10-16
文章编号：1005-9369（2015）01-0068-06
文献标志码：A
中图分类号：S858.28；Q785
