陈皮、青皮中4种黄酮成分的比较研究

邱蓉丽，吴玉兰，乐 巍

(南京中医药大学，江苏南京 210023)

陈皮和青皮均为中医临床常用理气药，陈皮来源于芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的成熟果皮，青皮来源于橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的幼果和未成熟果皮。虽然两者原植物相同，但由于采收时间不同，其临床功效差异较大。古人对此早有认识，陈嘉漠《本草蒙荃》曰“青皮、陈皮一种，因其迟早采收，特分老嫩而立名也。嫩者性酷治下，老者性缓治高”;李时珍在《本草纲目》中描述“陈皮浮而升，入脾肺气分;青皮沉而降，入肝胆气分，一体二用”［1］。

陈皮、青皮中主要含两种类型的黄酮类成分:一类是黄酮苷类，如柚皮苷、橙皮苷等二氢黄酮苷类;一类是多甲氧基黄酮类，有橘皮素、川陈皮素等［2-4］。《中国药典》2010年版仅以橙皮苷作为指标性成分评价陈皮及青皮的质量［5］。为了更好地比较青皮、陈皮药材中黄酮类成分的差异及其对功效的影响，本实验选择2个黄酮苷 (柚皮苷、橙皮苷)、2个多甲氧基黄酮 (橘皮素、川陈皮素)作为指标比较不同产地陈皮、青皮中黄酮，为解释陈皮、青皮“一体二用”的机理提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪;Waters 2996二极管阵列检测器。

1.2 材料 陈皮、青皮药材分别收购于浙江，湖北，广东。浙江、湖北产陈皮、青皮经南京中医药大学药学院乐巍副教授鉴定为橘Citrus reticulata Blanco的干燥成熟果皮及干燥幼果。广东产陈皮、青皮购于广东新会，经鉴定为茶枝柑Citrus retculata Chachi的干燥成熟果皮及干燥幼果。橙皮苷(hesperidin)、柚皮苷 (naringin)对照品购自中国药品生物制品检定所，批号分别为110721-200613、110722- 200610;川陈皮素 (nobiletin)和橘皮素(tangeretin)对照品购自上海融禾医药科技有限公司，批号分别为071209和071126，上述2种对照品的纯度均大于98%。

1.3 试剂 乙腈、甲醇为色谱纯，水为纯净水(娃哈哈)，其余试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 HPLC色谱条件 Waters xbridge C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈-0.5%醋酸水，梯度洗脱 (0～20 min，10% ～25%乙腈;20～35 min，25% ～70% 乙腈;35～ 38 min，70%～95%乙腈);体积流量1 mL/min;柱温30℃;检测波长283 nm;进样量10 μL。在该条件下，对照品、青皮药材、陈皮药材色谱图见图1。

2.2 供试品溶液的制备 取陈皮药材粉末 (过60目筛)0.5 g，精密称定。精密加入50 mL甲醇，精密称定，超声提取30 min，称定补足质量，摇匀。溶液经微孔滤膜滤过，即得。

图1 对照品 (A)、青皮 (B)、陈皮 (C)药材HPLC分析色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，Citri reticulatae Pericarpium Viride(B)and Citri reticulatae Pericarpium(C)

2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取橙皮苷8.65 mg、柚皮苷7.30 mg、川陈皮素3.35 mg、橘皮素4.65 mg，甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得质量浓度分别为 0.865、0.73、0.335、0.465 mg/mL的混合对照品贮备液，备用。

2.4 线性关系考察 精密移取混合对照品贮备液0.1、0.4、0.6、0.8、1、2、4 mL至10 mL量瓶，甲醇定容，稀释配制成7个质量浓度水平的对照品溶液。按“2.1”项色谱条件，对不同质量浓度的对照品溶液进行HPLC测定。分别以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行回归计算，绘制标准曲线。柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素的回归方程分别为Y=21155046X+30186，r=0.9999;Y=19405940X+18898，r=0.9998;Y=21096914X+82019，r=0.9999;Y=24795631X+26100，r=0.9999。结果表明柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素进样质量浓度在0.00730～0.292 mg/mL、0.00865～0.346 mg/mL、0.00335～0.134 mg/mL、0.00465～0.186 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 同一混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，结果4种黄酮的峰面积RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取新会广陈皮药材6份，按“2.2”项下制备供试品溶液。按“2.1”项色谱条件测定供试品中黄酮。结果橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素、橘皮素平均含有量分别为3.16%、0.033%、0.48%、0.32%，RSD均小于3%，保留时间RSD均小于3%。表明测定方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录4个黄酮的峰面积。结果橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素和橘皮素的保留时间和峰面积的RSD均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 称取已知各成分含有量的新会广陈皮 (橘皮素、川陈皮素、橙皮苷、柚皮苷分别为 3.2、4.8、31.6、0.33 mg/g)0.25 g，精密称定。分别精密加入橘皮素、川陈皮素、橙皮苷、柚皮苷的混合对照品溶液 (质量浓度分别为0.995、1.417、1.981、0.132 mg/mL)0.6、0.8、1 mL，按“2.2”项下方法制得供试品溶液，按“2.1”项下方法进样分析，计算加样回收率。结果见表1。

2.9 样品测定 广陈皮、陈皮、广青皮、青皮药材，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下方法测定峰面积，采用外标法计算药材中4种黄酮成分的量。结果见表2。

由表2可知，各地产陈皮、青皮药材中4种黄酮类成分均以橙皮苷含有量为最高，柚皮苷含有量最低。《中国药典》2010年版规定陈皮中橙皮苷含有量不得少于3.5%，青皮中橙皮苷的量不得少于5%［5］。浙江和湖北产陈皮和青皮中橙皮苷的含有量均符合《中国药典》标准，但这两个产地青皮中多甲氧基黄酮川陈皮素和橘皮素的量要远大于陈皮。产于广东新会的广陈皮是陈皮的一种，但从测定结果看，新会陈皮、青皮中橙皮苷的量均低于《中国药典》2010年版要求，新会陈皮和青皮中川陈皮素和橘皮素的含有量相差不大。

3 讨论

3.1 《本草纲目》引用朱丹溪方曰:青皮治因久积忧郁，乳房内有核如指头，不痛不痒，五七年成痈，名乳癌。用青皮四钱，水一盏半，煎一盏，徐徐服之，日一服，或用酒服［1］。本实验研究发现3个不同产地的青皮中多甲氧基黄酮 (川陈皮素、橘皮素)的量均高于陈皮。其中浙江、湖北产的青皮中川陈皮素量分别是陈皮的20倍和23倍，橘皮素量是陈皮的14倍和15倍。药理作用显示多甲氧基黄酮抗癌活性较强［6-7］，其中川陈皮素可通过下调COX-2的表达，上调Bax的表达，显著抑制肝癌细胞生长，减弱细胞生长因子诱导肝癌细胞的转移［8-9］;可抑制人胃癌细胞的增殖和转移［10-11］及p53突变的人胃癌细胞的生长［12］;体外和体内实验均表明川陈皮素有抗肺癌细胞增殖活性［13］。橘皮素可将人乳腺癌细胞周期阻断在G1期而显著抑制肿瘤细胞的生长［14］，并可抑制黑色素瘤发生肺转移［15］。本实验研究结果对于解释青皮可用于治疗气血瘀滞之癥瘕，而陈皮无此功效有一定启示。

表1 加样回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests

表2 不同产地青皮、陈皮中4种黄酮的量Tab.2 Determination of flavonoids in Citri reticulatae Pericarpium and Citri reticulatae Pericarpium viride collected from different growing areas

3.2 本研究发现浙江、湖北产青皮、陈皮中橙皮苷的量符合《中国药典》标准，而广东产广陈皮、青皮中橙皮苷量达不到《中国药典》标准。本课题组曾收集多批新会产广陈皮样品，测定发现广陈皮中橙皮苷的量均较低，多批次均达不到《中国药典》标准。但来源于茶枝柑的广陈皮中多甲氧基黄酮 (川陈皮素、橘皮素)的量要远高于来源于橘的陈皮，分别是其11倍和8倍，此种含有量上的差异能否引起陈皮与广陈皮功效的不同有待于进一步研究。

3.3 在流动相的选择中，比较了甲醇-水、乙腈-水及在流动相中添加不同质量的酸对样品分离的影响。结果显示在流动相中添加酸，可使样品峰形更对称;乙腈-酸水系统对川陈皮素和橘皮素的分离度比甲醇－酸水系统好。最终确定流动相体系为乙腈-0.5%醋酸水体系，4种成分可以达到基线分离。

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