食用菌拮抗反应的定量分析

刘 昆 宋小亚 蒋 俊 路新彦

（丽水农业科学研究院，浙江 丽水 323000）

食用菌拮抗反应的定量分析

刘 昆 宋小亚 蒋 俊 路新彦

（丽水农业科学研究院，浙江 丽水 323000）

应用Photoshop软件对拮抗反应中的菌丝生长面积进行量化分析。试验采用18个香菇菌株，经对各菌株菌丝培养，测量相对生长面积，计算对照菌株L808对其他17个菌株的拮抗系数。以拮抗系数为依据，判别各参试菌株的拮抗能力，拮抗系数越大，其拮抗能力越强。此可作为食用菌菌种鉴别新的量化指标参数。

Photoshop；拮抗反应；香菇

担子菌中的拮抗现象（antagonism）是由多基因控制的异源不亲合反应。控制两个菌株双核菌丝体不亲合性的多个基因位点只要有一处不同，菌丝体相互接触时不亲合反应就会发生，并会在接触区出现色素，菌丝隆起和菌丝稀疏等［1］。因拮抗反应的试验操作简单，结果也比较容易辨别，常被用于食用菌的菌种鉴别研究。但以往的研究多关注拮抗线部位的形态特征，而未对菌丝生长面积的大小做过探讨。

随着科技的进步，数字化图像处理和分析技术在多个行业中被广泛应用。Photoshop软件因其图像处理功能强大常被科研工作者应用。利用软件中直方图分析不规则形状面积的方法在林业遥感测量、医疗中瘢痕计算、植物病斑面积计算等工作中发挥了重要功能［2～4］。本文在他人的研究基础上，介绍一种应用Photoshop软件对拮抗反应中菌丝生长面积进行量化分析的方法。

1 试验材料及方法

1.1 试验材料

18个香菇菌株，分别为L808、L868、L135、L9015、L939、L241-4、庆科20、武香1号、苏香1号、申香1号、申香2号、申香8号、申香10号、申93、L26、Cr04、Cr66和Cr33，均由丽水市农业科学研究院大型真菌种质资源库提供。

Adobe Photoshop CS6 简体中文试用版由Adobe公司的中文主页下载而得。

1.2 试验方法

（1）菌丝的培养。培养基量为每皿20 mL，在培养皿底部（直径90 mm，下同）平面上，距圆心15 mm处分别作直径为5 mm的圆，灭菌备用。将供试菌株转接至PDA试管中，25 ℃黑暗条件下活化培养。试管长满菌丝后，将菌株接种至PDA平板的中央，在25 ℃黑暗条件下培养。

当菌丝长至培养皿的2/3面积时，用直径5 mm的打孔器在菌丝边缘打孔，取菌丝块。分别将L808与其他17个菌株的菌丝块接种到上述备用培养皿圆中，于25 ℃黑暗下对峙培养。当两菌株菌丝相互接触后，在光下培养5～7天。培养结束后，对每个培养皿在相同的拍摄参数上进行正反面拍照。

（2）菌丝相对生长面积的测量。用Photoshop软件打开培养皿背面的拮抗照片。菜单栏中选择“图像—调整—曲线”，打开曲线调整对话框，向下调整曲线中间调（图1），提高菌丝与背景之间及拮抗线自身的清晰度。工具栏中选取“磁性套索工具”，羽化值设为3，沿拮抗线和培养皿的边缘选取一个菌株的菌丝覆盖处。菜单栏中选择“窗口—直方图”调出直方图对话框（图2），记录其中的像素数，记做P1。同样的方法测量整个培养皿底部的像素数，记做P2。

图1 曲线调整对话框

图2 从直方图中读取整个培养皿的像素信息

（3）相对生长面积的计算。试验原理参照参考文献［4］，方法略有修改。数码照片的分辨率是单位长度上容纳像素的数量。通常所讲72像素的分辨率指1英寸长度的位置上包含72个像素，即1平方英寸面积上含有72×72=5 184个像素。因此数码照片中的实际面积S可以用其所包含的像素数P除以分辨率R得到。拮抗反应试验同一照片（分辨率R相同）中两不同菌丝覆盖面积的比值A（以下称为拮抗系数）可用下列公式求得：

S1表示测试菌株的菌丝生长面积；S2表示对照菌株的菌丝生长面积；P1表示测试菌株菌丝所覆盖培养皿的像素数；P2表示整个培养皿的像素数，R表示分辨率。

2 结果与分析

2.1 图片的选用

拮抗反应试验中L808与大部分菌株均有明显的拮抗反应，培养皿中不同的菌株以拮抗线为分界线形成了2个区域，界限明显，方便软件进行测量。但也有部分菌株，从培养皿正面观察不易分清两者菌丝的生长边界，而培养皿背面则非常容易将两者区分开（图3）。同时因拮抗时所用的菌株菌丝一般均为同一颜色，而且某些菌株因其特性会形成色素、菌丝球和菌落不均匀等现象，会干扰软件的测量。因此测量数据时，以培养皿背面的图片为好。

图3 L808与L135的拮抗反应试验正面（左）与背面（右）

图4 L808对其他菌株的拮抗系数曲线

试验中的数据以照片中的像素数为基础，因此在拍照时，图片的参数要统一标准。

2.2 拮抗能力分析

根据L808对其他17个菌株拮抗系数的分析结果（图4），拮抗系数曲线呈明显的上升趋势。随着拮抗系数的增加，L808对其他菌株的拮抗能力依次增强，其中对L868的拮抗能力最弱，对L135的拮抗能力最强。

根据统计分析结果（表1），按照显著性差异大小，可将17个试验菌株分成7组：L868、Cr04、L26、申香1号4个菌株为第1组；申香8号、Cr33、武香1号、L939、苏香1号、申香2号、申93共7个菌株为第2组；申香10号、Cr66为第3组；L241-4、L9015、庆科20、L135分别单独成为第4、第5、第6、第7组。

L808与第一组菌株之间的拮抗系数小于1，说明其菌丝对组中菌株的拮抗能力较弱；L808与第2组菌株间的拮抗系数接近于1，说明其菌丝对组中菌株的拮抗能力相当；L808与第3组的拮抗系数均超过了1但小于1.3，说明其菌丝对被测菌株的拮抗能力较强；L808与第4、第5、第6、第7组的拮抗系数均超过了1.3，甚至接近2，说明其菌丝对被测菌株的拮抗能力非常强。由此可见，拮抗系数可有效地分析出L808对不同菌株拮抗能力的大小。

表1 L808对不同菌株的拮抗系数

3 讨 论

在药物的抑菌试验中，常通过抑菌圈的大小来判断药物的抑菌效应。其操作是将供试菌涂布于整个培养皿中，在其上接种待测药物。抑菌圈一般是规则的圆形，只需要测定圆的直径便可测量出抑菌能力大小。而食用菌的拮抗反应试验一般是两个菌株或多个菌株近距离的对峙培养，其菌丝生长速度快，在出现拮抗现象时，菌丝已经布满培养皿，形成两个或多个不规则的扇形区，手工不易准确测量其面积的大小。本文结合药物抑菌实验的原理，应用Photoshop软件的直方图像素信息，实现对食用菌拮抗反应中菌丝相对生长面积的测量。

以往利用拮抗反应鉴别菌种过程中，会出现因拮抗反应现象不明显、试验操作不规范和各人观察角度不同，导致试验结论有误差，影响鉴别结果的准确性。本研究通过用电脑软件测量菌丝生长面积的方法，实现对不同菌株间的拮抗能力鉴别，辅助拮抗反应最终结果的判定，增加拮抗试验的准确性。当两菌株之间无明显的拮抗反应，而拮抗系数明显小于或大于1时，则表示两菌株有差异的概率明显提高。

通过比较新品种与对照菌种的拮抗系数，可实现对其生长势的判断。测量新品种与对照菌之间拮抗系数的大小，还可判断其抑菌能力。因此，拮抗系数可在食用菌育种试验中作为一种新的量化指标应用。

［1］ 沈学香， 尚晓冬， 汪虹， 等. 十株香菇菌株间的营养体不亲合性［J］. 食用菌学报， 2008， 13（2）: 1-5.

［2］ 王新， 杨书涛. Photoshop在林业工作中计算面积的方法和应用［J］. 林业科学， 2012， 11: 60.

［3］ 周洲， 张军锋， 陈建， 等. Photohshop软件在免疫组化图像分析中的应用［J］. 安徽农业科学， 2012， 40（24）: 11963-11965.

［4］ 崔华威， 杨艳丽， 黎敬涛， 等. 一种基于Photoshop的叶片相对病斑面积快速测定方法［J］. 安徽农业科学， 2009，37（22）: 10760-10762， 10805.

S646

A

2095-0934（2015）06-364-03

丽水市科技计划项目（2012JYZB26）

刘昆（1984—），男，助理研究员，硕士研究生，主要从事食用菌菌种质量检测工作。E-mail：tjliukun@126.com