蛹虫草原生质体60CO辐射诱变选育高产多糖菌株的实验

石小峰沈福良张 强于园园张作法吕国英*

（1. 嘉兴市潜福食品有限公司，浙江 嘉兴314050；2. 嘉兴市潜鑫食品有限公司，浙江 嘉兴314050；3. 浙江省农业科学院园艺研究所，杭州 310021）

蛹虫草原生质体60CO辐射诱变选育高产多糖菌株的实验

石小峰1沈福良1张 强2于园园2张作法3吕国英3*

（1. 嘉兴市潜福食品有限公司，浙江 嘉兴314050；2. 嘉兴市潜鑫食品有限公司，浙江 嘉兴314050；3. 浙江省农业科学院园艺研究所，杭州 310021）

蛹虫草；原生质体；辐射诱变；多糖

蛹虫草Codyceps militaris （L.） Link，又称北冬虫夏草，是虫草的模式菌种。蛹虫草的功效成分和药效，与野生冬虫夏草相似［1，2］，可以作为野生冬虫夏草的有效替代品。蛹虫草含有多种活性物质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗感染等多种药理活性。虫草多糖是一类高分子复合物，为虫草的主要活性成分之一，是虫草中含量最高的药理活性物质［3］。虫草多糖主要存在于菌丝体中，研究提高菌丝体中多糖含量具有重要意义。

原生质体技术是通过制备具有生物全能性的原生质体，并结合诱变、杂交、转基因等技术培育变异新类型的生物技术［4］。辐射育种有着常规育种和杂交育种不可替代的特殊效应，通过辐射诱发突变不仅可以改良品种，而且可以创造新的种质资源。原生质体60Co辐射诱变技术以其周期短、操作简便的优点被广泛采用。

我们通过对蛹虫草的原生质的60Co辐射诱变，选育出多糖含量高的优质菌株。进一步开发利用蛹虫草创造条件。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株为蛹虫草M，由浙江省农业科学院园艺研究所食用菌实验室保存。溶壁酶，购自广东省微生物研究所。蜗牛消化腺干粉，由嘉兴市潜福食品有限公司提供。葡萄糖、苯酚、硫酸、硫酸镁等均为分析纯试剂。

1.2 培养基

PDA培养基（g/L）：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%；液体培养基（g/L）：马铃薯20%，葡萄糖2%；再生培养基（g/L）：在PDA培养基中添加蜗牛消化腺干粉20 g，MgSO4·7H2O 147.9 g。

1.3 方法

（1）菌丝培养。菌株的活化及扩大培养，将冷藏的PDA斜面菌种转接到平板中，放置于25 ℃培养箱中培养6～8天，然后转接至液体培养基培养5～6天，再连同培养基一起转移至匀浆器中，并加入一定量的液体培养基，匀浆后分装至预先装有液体培养基的三角瓶中，25 ℃静置培养3 d备用。

（2）原生质体制备与再生。0.2 g 溶壁酶溶于10 mL 0.6 mol/L的硫酸镁溶液中，经0.2 μm细菌过滤器过滤，制成酶液。过滤并收集液体培养的菌丝，用无菌水冲洗后再用无菌吸水纸吸干菌丝水分，将菌丝转移到酶液中，轻微振荡使其均匀分散，置于30 ℃、60 r/min 摇床中酶解3 h。用G-2 砂芯漏斗过滤除去酶解液中的残留菌丝，将收集的滤液在4 ℃、3 000 r/min 条件下离心10 min，弃上清，沉淀，用0.6 mol/L 的硫酸镁洗涤2～3次即得到纯化的原生质体。

（3）60Co辐射诱变处理。将原生质体稀释至适当浓度用血球计数板计数，吸取200 μL经稀释的原生质体悬液用不同60Co辐射剂量（30 Gy，50 Gy，100 Gy，150 Gy）分别处理30 min。

（4）变异菌株筛选。吸取100 μL诱变后的原生质体悬液于再生培养基上，用涂布棒涂布均匀，25 ℃倒置培养7～10天可见再生菌落。挑选出一部分单菌落和部分杂交菌落，接种至PDA固体斜面培养基上。置于25 ℃恒温培养5～7天。观察菌丝体生长状况，并与未诱变的对照组进行比较。挑选出一部分与对照组有差异的菌株，接种至液体发酵培养基中，进行摇床发酵培养，测定发酵液的多糖含量。

（5）多糖测定。发酵液多糖含量的测定采用以下公式：发酵液总多糖含量—发酵液还原糖含量=胞外多糖含量。多糖测量方法采用苯酚-硫酸法，还原糖的测定采用DNS法。

2　结果与分析

2.1 原生质体形态

取适量原生质体置于40倍光镜下进行镜检，观察形态。图1中呈现黑点且四周透明的即为蛹虫草原生质体。还有一部分呈现条状的为未酶解的菌丝体。

图1 蛹虫草原生质体形态

2.2 诱变后再生菌株的生长情况

从再生培养基上挑选出一部分单菌落接种于PDA斜面培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中培养1周后观察菌株的生长情况和菌丝形态。结果（图2）为：部分单菌落生长明显快于其他菌株，且有部分菌株的菌丝体外形与其他组有显著的不同。

图260Co辐照诱变1周后各菌落生长情况

表1 筛选的菌株胞外多糖含量

2.3 胞外多糖含量

将菌丝体形态和长势与对照组明显不同的菌株接种于50 mL液体发酵培养基中，于25 ℃恒温摇床发酵培养5～7天，随后过滤菌丝体，测定干重，清液用于测量胞外多糖。结果（表1）可以看出，挑选的20株菌株中，多糖含量提高的有8株，其正突变率达40%；其中，13号菌株胞外多糖含量最高，为195.48 mg/g菌丝，比对照提高了46.2%。

3 讨 论

微生物菌种选育是建立在遗传和变异基础上的，一个菌种的生物合成物的产量和质量取决于该菌种内部遗传基因的结构和功能。通过改变微生物遗传物质的结构就能影响其生物合成产物，包括化学结构、合成能力，以及产物的活性等［5］。而后通过一定的手段，从众多的变异菌株中筛选出产量高，性状优良的突变株，进一步研究测试其最佳生长温度和培养基成分等。

本实验通过60Co辐照诱变，成功获得了几株蛹虫草诱变新菌株，与出发菌株相比，其胞外多糖产量提高很多。原因可能为经过电离辐射后，出发菌株内部遗传物质发生变化，如DNA序列的改变，或者DNA上碱基对的变化等，其生物合成能力提高所致，这其中可能是编码某个酶的序列的改变，或是合成多糖的编码单位增加而使其活性增加。

本实验所获得的研究成果为以后的蛹虫草新品种培育提供了有益的参考，也为蛹虫草在食品药品方面的应用提供了可以借鉴的观点，有益于改善蛹虫草的产业前景。

［1］ Li SP，Yang FQ，Tsim KW. Quality control of Cordyceps sinensis， a valued traditional Chinese medicine［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2006， 41: 1571- 1584.

［2］ 王建芳， 杨春清. 蛹虫草有效成分及药理作用研究进展［J］.中药研究进展， 2005， 22（ 5） : 30-32.

［3］ Jong SL， Jeong SK， Dong PW， et a1. Study on macrophage activation and structural characteristics of purified polysaccharide from the liquid culture broth of Cordyceps millitaris［J］. Carbohydrate Polymers， 2010， 82: 982-988.

［4］ 田丰伟， 程传荣， 袁维涵， 等. 原生质体诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌株［J］. 微生物学通报， 2010， 37（10）: 1457-1461.

［5］ 施巧琴， 吴松刚. 工业微生物育种学［M］. 北京：科学出版社， 2009.

S646

A

2095-0934（2015）06-371-03

嘉兴市南湖区项目（2014QN06）；浙江省食用菌育种专项（2012C12911）

吕国英，博士，浙江省农科院副研究员，主要从事食药用菌研究工作，E-mail：bdzlgy@sohu.com