木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+（/NH4）2SO4双水相体系中亲和分配行为研究

彭　健，张海德，董安华，许英豪，蔡　涛，王伟涛，刘长玲

（海南大学食品学院，海南海口570228）

木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+（/NH4）2SO4双水相体系中亲和分配行为研究

彭健，张海德*，董安华，许英豪，蔡涛，王伟涛，刘长玲

（海南大学食品学院，海南海口570228）

目的：研究木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4亲和双水相体系中分配行为。方法：采用浊点法，构建双水相相图，考察各成相剂对木瓜蛋白酶活性的影响；研究不同PEG4000和（NH4）2SO4的质量分数、不同PEG-IDA-Fe3+的取代量时，木瓜蛋白酶在两相体系中分配行为的变化；用响应面法优化亲和双水相萃取木瓜蛋白酶的最佳分离条件；同时对木瓜蛋白酶在萃取体系中的结构进行表征。结果：当两相体系中pH6.9，PEG4000质量分数16%，（NH4）2SO4质量分数20%，PEG-IDA-Fe3+为3%时，木瓜蛋白酶的上相酶活性回收率达90.5%，蛋白分配系数达1.85，而其在PEG/（NH4）2SO4中的酶活回收率及蛋白分配系数都低于PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4亲和双水相体系。结论：PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO亲和双水相系统能有效提高木瓜蛋白酶的分配效果，采用Fe3+螯合PEG成相剂的双水相萃取木瓜蛋白酶条件温和，不影响酶的特征结构。

亲和双水相，PEG-IDA-Fe3+，木瓜蛋白酶，分配行为

木瓜蛋白酶（EC3.4.22.2）是由212个氨基酸残基组成的一种含巯基（-SH）肽链的内切酶，有耐高温、稳定性好、蛋白质水解能力强等特征，作为一种工业酶制剂广泛应用于医药、细胞分离、食品、清洁剂、皮革纺织和制药［1］。但粗木瓜蛋白酶制品，即使经过分离纯化，其纯度仍然不高，难以在医药、精细化工等方面得到广泛应用。因此，对木瓜蛋白酶分配行为和机制的研究非常紧迫。双水相体系（Aqueous twophase system）是指某些亲水性的高分子聚合物与聚合物或聚合物与无机盐溶解在水中，形成互不相溶的两相或多相的体系［2］。生物物质通过氢键、电荷作用、范德华力、疏水力、空间效应等与双水相体系产生相互作用，从而达到萃取分离的目的。亲和双水相主要有两种存在形式：一是制备亲和成相剂，在成相聚合物中接入具有亲和作用的金属离子或基团［3-4］，二是添加游离的亲和配基［5-6］。Ling YQ等［7］将亲和染料Reactive Red 120添加到PEG/（NH4）2SO4双水相系统中，发现游离亲和染料Reactive Red 120对木瓜蛋白酶的分配无明显影响。HSC Barbosa等［8］，发现PEGIDA-Cu2+的添加量能有效提高DNA的纯化效果；肖进新等［9］实验证明亲和配基的引入极大地增强了蛋白质分配的选择性。

本文拟采用PEG4000制备PEG-IDA-Fe3+，代替PEG/（NH4）2SO4双水相体系中的部分PEG，形成亲和双水相，探讨木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4亲和双水相中的分配行为，并对萃取体系中的木瓜蛋白酶进行结构表征，为高纯度、高活力木瓜蛋白酶的制取提供理论指导。

表1　酪氨酸标准溶液Table 1　Tyrosine standard solution

1　材料与方法

1.1材料与仪器

聚乙二醇4000（CP）、干酪素（CP）、硫酸铵（AR）、G-250国药集团化学试剂有限公司；木瓜蛋白酶（3500U/mg） 生工生物有限公司；PEG-IDA-Fe3+（螯合率0.6mol/mol）实验室参照Lin等［10］的方法制备；其他试剂均为市售分析纯。

PL303分析天平梅特勒—托利多（上海）有限公司；TU1901紫外可见分光光度计北京普析通用有限责任公司；TENSOR27傅里叶变换红外光谱仪德国Bruker公司；DK-98-1型恒温水浴锅天津泰斯特仪器有限公司；PHS-3C型pH计上海雷磁仪器厂；SHA-2恒温振荡器常州澳华仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1木瓜蛋白酶活性的测定配制100μg/mL标准酪氨酸原液，按表1所示稀释，测其在275nm处的吸光值，绘制标准曲线。以酪蛋白为底物，测木瓜蛋白酶在10min内水解产生的酪氨酸在275nm处吸光值，计算上相中木瓜蛋白酶的酶活浓度［11］。

1.2.2蛋白含量的测定采用Bradford方法［12］，以牛血清蛋白（BSA）为基准蛋白。配制100μg/mL蛋白原溶液，按表2稀释，在595nm处测吸光度，绘制标准曲线。

表2　牛血清蛋白标准溶液Table 2　Bovine serum albumin standard solution

1.2.3双水相相图的制备将PEG4000、PEG-IDAFe3+和（NH4）2SO配成50%的原溶液，准确称量一定质量的PEG4000原溶液于50mL小烧杯中，边振荡边滴加（NH4）2SO4原溶液，至混合液出现混浊，再加入适量的去离子水，使体系变澄清，继续加入（NH4）2SO4原溶液，使体系再次变混浊，反复操作多次，分别记录每次加入的（NH4）2SO4和去离子水质量，计算体系达到混浊时PEG4000和（NH4）2SO4在体系中的质量分数，绘制PEG4000/（NH4）2SO4双节线图。

1.2.4亲和双水相萃取木瓜蛋白酶配制一定质量分数的PEG4000、PEG-IDA-Fe3+和（NH4）2SO4原溶液，调节至所需pH。根据不同的双水相体系，计算加入PEG4000、PEG-IDA-Fe3+和（NH4）2SO4原溶液的量，加入2mL酶含量为10mg/mL酶溶液，然后加去离子水至20.0g。常温下振荡30min后，静置45min，使分相清晰。测定上下相体积，分取上下相，稀释后分别测定其酶活性和蛋白含量。计算上下相蛋白分配系数Kp和酶活性回收率Y（%）。公式如下：

Kp=上相蛋白浓度/下相度蛋白浓度

Y（%）=上相酶活性浓度×上相体积/加入系统酶活性总量×100

1.3单因素实验设计

1.3.1各双水相组分对木瓜蛋白酶活性的影响配制质量分数分别为1%、3%、5%、7%、9%的PEG-IDAFe3+，质量分数分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%的PEG4000和（NH4）2SO4溶液，各取9mL分别加入1mL酶含量为10mg/mL的酶液，涡旋混合后静置45min。取0.25mL稀释40倍后，按1.2.1的方法测定木瓜蛋白酶的活性，对照组中不同质量分数溶液用水代替。

酶活比X（%）=成相剂存在时酶活性/对照组酶活性×100

1.3.2（NH4）2SO4对分配行为的影响固定双水相中PEG的质量分数为20.0%（w/w），pH7.0，酶添加量1.0mg/g，考察不同质量分数（NH4）2SO4对分配行为的影响。

1.3.3PEG4000对分配行为的影响固定双水相中（NH4）2SO4的质量分数为21.0%（w/w），pH7.0，酶添加量1.0mg/g，考察不同质量分数PEG4000对分配行为的影响。

1.3.4PEG-IDA-Fe3+取代量对分配行为的影响确定双水相中（NH4）2SO4和PEG4000的最佳萃取条件后，分别用PEG-IDA-Fe3+取代原双水相中的部分PEG4000，考察不同PEG-IDA-Fe3+的取代量对分配行为的影响。

1.4响应面实验设计

在预实验与单因素的实验基础上，采用BBD（Box-behnken Design）实验设计，对pH（X1）、PEG质量分数（X2）、（NH4）2SO4质量分数（X3）、PEG-IDA-Fe3+质量分数（X4）四个因素进行优化，选取酶活性回收率（Y%）和分配系数（Kp）为考察指标，以获得亲和双水相萃取木瓜蛋白酶的最佳条件，实验因素的水平编码表见表3。

表3　响应面实验因素与水平编码表Table 3　List of coded factors and levels for RSM

1.5结构表征

分别取含酶亲和双水相的上相、木瓜蛋白酶液以及不含酶的双水相上相1mL，稀释10倍，在260～320nm进行光谱扫描。分别取3mg木瓜蛋白酶、PEG4000以及含酶双水相中上相干燥粉末，与一定量的KBr研磨，用压片机压片后，在400～4000cm-1范围内进行FT-IR光谱检测。

1.6数据处理

使用Design Expert 8.0和Origin 8.0对实验数据进行处理和分析，每组实验均重复3次。

2　结果与分析

2.1酪氨酸标准曲线

酪氨酸标准曲线如图1所示：y=0.0073x+0.0006，R2=0.9991，符合实验要求。

图1　酪氨酸标准曲线Fig.1　Tyrosine standard curve

2.2牛血清蛋白标准曲线

牛血清蛋白标准曲线如图2所示：y=0.0076x+ 0.0178，R2=0.9968，符合实验要求。

2.3PEG-IDA-Fe3+和PEG4000相图的比较

综合文献［3］报道，选择10%的PEG被PEG-IDAFe3+取代，绘制双节线图如图3所示，亲和成相剂加入后，上下两相间的差异变大，相图不对称性增强。这是因为PEG螯合金属离子后，分子上的极性基团（羟基）被部分取代，导致PEG分子极性程度减弱，PEG溶液和（NH4）2SO4溶液之间的憎水性差别增大，造成更大的分相推动力，导致双结点曲线与原相图曲线有所不同。但是亲和成相剂的加入，对该体系相图的双节点曲线的影响不大，相图的构建，为本研究中双水相系统成相剂浓度的选择提供依据。

图2　牛血清蛋白标准曲线Fig.2　Bovine serum albumin standard curve

图3　10%的PEG4000被PEG-IDA-Fe3+取代的PEG/（NH4）2SO4系统相图Fig.3　Phase diagrams of PEG/（NH4）2SO4with 10%PEG4000 substituted by PEG-IDA-Fe3+

2.4成相剂对酶活的影响

图4　不同质量分数的PEG-IDA-Fe3+对酶活性的影响Fig.4　Effect of concentration of PEG-IDA-Fe3+on the activity of enzyme

图5　不同质量分数的PEG4000和硫酸铵对酶活性的影响Fig.5　Effect of concentration of PEG4000 and（NH4）2SO4on the activity of enzyme

各成相剂对酶活影响，如图4和图5所示，PEGIDA-Fe3+对木瓜蛋白酶活性产生微弱的抑制作用，当其添加量达到9%时，酶活比仍在95%以上；PEG4000对酶活性几乎没有影响，高浓度的（NH4）2SO4也会对酶活产生一定抑制，这种抑制一般是可逆的。在实验过程中PEG-IDA-Fe3+添加量不会超过9%，（NH4）2SO4浓度不会超过22%，因此由各组分形成的双水相体系，不会对酶的活性造成太大影响。

2.5体系中各组分质量分数对分配行为的影响

2.5.1（NH4）2SO4对分配行为的影响（NH4）2SO4质量分数对酶分配影响，结果如图6所示：Y和Kp随着（NH4）2SO4浓度的增大而迅速增大，在19%～21%存在最大值。说明在双水相萃取过程中，盐析作用也是使木瓜蛋白酶趋于上相的重要原因之一；但随着盐浓度的增大，一方面对酶活性产生了一定抑制，另一方面盐含量的增加也使相比减小，使上相酶含量降低。综上，选取中间值20%作为响应面实验的零水平。

图6　（NH4）2SO4质量分数对木瓜蛋白酶分配行为的影响Fig.6　Effect of（NH4）2SO4concentration on partitioning behavior

2.5.2PEG4000对分配行为的影响PEG4000质量分数对酶分配的影响结果如图7所示：Y和Kp随着PEG4000浓度的增大而增大，在浓度为19%时达到最大而后又随之减小。这是由于PEG4000的浓度增大，系线长度增加，体系两相性质差别增大，木瓜蛋白酶趋于分配在上相，而浓度继续增大则上相粘度增加，酶分子与PEG4000在两相界面形成一层乳状膜，使酶向上相转移困难而集中在两相之间。因后期响应面实验要加入PEG-IDA-Fe3+，故降低PEG4000的浓度进行后续实验，因此选择16%进行响应面实验。

图7　PEG4000质量分数对木瓜蛋白酶分配行为的影响Fig.7　Effect of PEG4000 concentration on partitioning behavior

2.5.3PEG-IDA-Fe3+取代量对分配行为的影响固定双水相体系PEG4000 19%、（NH4）2SO421%、pH7.0、酶添加量1.0mg/g，用实验室制备的PEG-IDA-Fe3+取代体系中的PEG4000，考察PEG-IDA-Fe3+的取代量对分配行为的影响。图8可以看出，采用PEG-IDA-Fe3+代替部分原双水相中的PEG4000能有效的提高酶在上相的回收率和蛋白浓度比。当体系中PEG-IDAFe3+含量在3%～5%时有最好效果，其上相回收率可由原来的72.16%提高到80.43%，蛋白分配比由1.58提高到1.68。因此，响应面实验中选效果较好的3.5%为PEG-IDA-Fe3+作为零水平。过渡金属离子与蛋白质分子表面氨基酸残基，会产生配位结合、π键、静电力作用，因此添加一定量金属螯合亲和成相剂能有效提高酶的分配效果［13］；但取代量增大时，酶与金属离子的亲和接近饱和状态，并且PEG-IDA-Fe3+的取代量增大，酶活受到一定的影响而导致分配效果下降，实验结果与陆瑾、林东强等［14］利用EOPO/PES/EOPOIDA-Cu2+双水相体系萃取纳豆激酶的结果相似。

图8　PEG-IDA-Fe3+取代量对分配行为的影响Fig.8　Effect of PEG-IDA-Fe3+replacement on partitioning behavior

2.6PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4亲和双水相系统的响应面优化及结果分析

对表4数据进行二次多项回归拟合，得到两个响应值的二次多项回归模型：

Y（%）=89.92-0.49X1-3.23X2+4.72X3-3.81X4+ 0.86X1X2-4.5X1X3+0.58X1X4-3.46X2X3-14.4X2X4-7.95X3X4-12.07X12-11.88X22-26.54X32-20.68X42式（1）

Kp=1.83-0.015X1-0.082X2+0.097X3-0.14X4+ 0.030X1X2-0.11X1X3+0.007X1X4-0.073X2X3-0.32X2X4-0.21X3X4-0.23X12-0.25X22-0.57X32-0.44X42式（2）

方程（1）和方程（2）的R2为0.95和0.97，说明实验值和预测值之间相关度高，模型拟合性良好；校正R2分别为0.91和0.94，表明90%以上的实验数据的变异性可用此回归模型来解释。

对表4实验数据进行方差分析，结果见表5。两个回归模型的p值都小于0.01，回归方程极显著，拟合的二次回归方程合适。对式（1）中Y（%）回归方程中一次项系数的绝对值进行比较，得各因子影响从大到小依次为：（NH4）2SO4质量分数、PEG-IDA-Fe3+质量分数、PEG4000质量分数和pH；式（2）中各因子对Kp影响大小依次为：PEG-IDA-Fe3+质量分数、（NH4）2SO4质量分数、PEG4000质量分数和pH。表5的分析结果表明，在所选的各因素水平范围内，X2、X3、X4、X2X4、X3X4、X12、X22、X32、X42对Y（%）和Kp影响显著；X1X3对Kp影响显著而对Y（%）影响不显著；X1对Y（%）和Kp影响都不显著。这表明pH对酶在双水相中的分配行为影响不大，从侧面反映了木瓜蛋白酶有较宽的pH适应性。

对Y（%）和Kp的响应面图进行分析结果见图9，如图9（a）和图9（b）所示：PEG4000质量分数、（NH4）2SO4质量分数、PEG-IDA-Fe3+的质量分数对酶活回收率Y（%）的影响均类似抛物线，即随着PEG4000、（NH4）2SO4和PEG-IDA-Fe3+质量分数的增加，酶活回收率有先增后减的趋势。由图9（c）和图9（d）可知，PEG4000质量分数、（NH4）2SO4质量分数和PEG-IDA-Fe3+的质量分数对蛋白分配比Kp影响也呈抛物线形，因此在实际应用过程中，应控制PEG4000、（NH4）2SO4和PEGIDA-Fe3+的用量。图9中，Y（%）和Kp的最大值处于各因素条件变化范围之内，表明所选变化范围合理有效。

表4　响应面实验设计方案及结果Table 4　Experimental design and result of RSM（Actual）

图9　Y（%）和Kp的响应面Fig.9　3D responsive surface of Y（%）and Kp

在已建立的模型基础上，设定优化目标响应值Y（%）和Kp最大，通过Design Expert预测模型的最优条件为：pH=6.9、PEG4000质量分数16%、（NH4）2SO4质量分数20%、PEG-IDA-Fe3+质量分数3%，此时酶活回收率（Y）和蛋白浓度比（Kp）分别为90.50%和1.85。通过3次平行实验验证，得到Y和Kp的实验值分别为91.25%和1.87，实验值和预测值一致性良好，采用响应面法对木瓜蛋白酶在亲和双水相中分配条件的优化是有效的。

2.7木瓜蛋白酶在萃取体系中的结构表征

UV-vis光谱如图10所示，虽然上相介质对木瓜蛋白酶270nm以下的吸收光谱造成了一定的干扰，但木瓜蛋白酶在富集的上相和纯水中的最大吸收峰都出现在278nm处，且峰型基本一致，与不含酶的上相介质峰型完全不同。表明萃取到上相的木瓜蛋白酶没有与萃取介质反应，紫外吸收特征明显，结构稳定。

表5　实验结果方差分析Table 5　Variance analysis of test result

图10　木瓜蛋白酶在不同条件下的UV-vis吸收光谱Fig.10　UV spectra of papain in different conditions

傅里叶变换红外光谱（FT-IR）作为一种分析分子结构的有效手段，具有所需样品少、操作简便、测量速度快、易测定蛋白质的瞬间结构等众多优点［15］。蛋白质的红外吸收光谱主要是由一系列酰胺吸收带组成，其中，酰胺I带（Amide I 1600～1700cm-1）主要是C=O伸缩振动吸收，酰胺II带（Amide II 1480～1575cm-1）主要是C-N伸缩振动吸收，常用于多肽和蛋白质的构象研究［16］。从图11可以看出：萃取前木瓜蛋白酶的Amide I吸收峰在1650cm-1，Amide II吸收峰在1539cm-1；萃取后，在木瓜蛋白酶和亲和双水相上相的混合体系中，木瓜蛋白酶的两个吸收峰仍在相同的位置识别到，并无新的吸收峰形成。说明在亲和双水相中木瓜蛋白酶的二级结构并未发生变化，这与Zhiwen Bai等［17］研究离子液体双水相萃取蛋白质有相同的结论。由此可见，亲和双水相体系萃取蛋白质的条件温和。

图11　木瓜蛋白酶、亲和双水相上相、富含木瓜蛋白酶的上相FT-IR吸收光谱Fig11　FT-IR spectra of papain，top phase of ATPS，papain in the top phase of ATPS

3　结论

木瓜蛋白酶在PEG/（NH4）2SO4和PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4双水相体系中分配行为的对比，表明金属螯合亲和双水相能有效地提高双水相对木瓜蛋白酶的萃取效果。响应面确定PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4亲和双水相萃取木瓜蛋白酶的最佳条件：pH6.9、PEG400质量分数为16%、（NH4）2SO4质量分数为20%、PEGIDA-Fe3+质量分数3%，此时木瓜蛋白酶上相酶活性回收率（Y）达90.5%，蛋白分配比（Kp）达1.85，得到的回归模型拟合度高，能很好的预测木瓜蛋白酶在双水相中的分配行为。对比体系中木瓜蛋白酶的UV-vis光谱和FT-IR光谱，其特征吸收峰未发生改变，表明亲和双水相萃取蛋白质的条件温和，不会破坏蛋白质的二级结构。

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Study of affinity partition behavior of papain in PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4aqueous two-phase system

PENG Jian，ZHANG Hai-de*，DONG An-hua，XU Ying-hao，CAI Tao，WANG Wei-tao，LIU Chang-ling
（Department of Food College，Hainan University，Haikou 570228，China）

Objective：To study the partion behavior of papain in affinity aqueous two-phase system（ATPS）which compossed of PEG，PEG-IDA-Fe3+and（NH4）2SO4.Methods：Investigated the phase diagrams of these two type of ATPS.Considered the influence of reagents on papain activity，and the effect of PEG4000 and（NH4）2SO4concentration，replacement rate of PEG-IDA-Fe3+on partition behavior were investigated.Optimization conditions of papain affinity partitioning were annalyzed using response surface methodology，and enzyme conformation before and after extraction was examinated.Results：The recovery（Y）and partition coefficient（Kp）of papain were achieved 90.5%and 1.85 respectively under the condition of pH6.9，PEG4000 16%（W/W），ammonium sulfate 20%（W/W），PEG-IDA-Fe3+3%（w/w）.Conclusion：PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4system could significantly improve the recovery（Y）and partition coefficient（Kp）of papain.The condition of affinity aqueous two-phase system which compossed of PEG-IDA-Fe3+were mild，would not damage the structure features of papain.

affinity aqueous two-phase system；PEG-IDA-Fe3+；papain；partion behavior

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0205-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.034

2014－09－26

彭健（1989-），男，硕士研究生，主要从事食品分离技术方面的研究。

张海德（1970-），男，博士，教授，主要从事食品分离技术方面的研究。

国家自然科学基金资助项目（31260401）；海南大学服务地方经济社会发展项目（HDSF201306）；海南大学2014年研究生科技创新项目。