定心藤醇提物不同极性部分的体外抗氧化活性研究

李维峰，王娅玲，郭　芬，高云涛

（1.云南农业大学热带作物学院，云南普洱665000；2.云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆明650031）

定心藤醇提物不同极性部分的体外抗氧化活性研究

李维峰1，王娅玲1，郭芬1，高云涛2，*

（1.云南农业大学热带作物学院，云南普洱665000；2.云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆明650031）

研究定心藤75%乙醇提取物不同极性部位的体外抗氧化活性，采用5种不同极性溶剂萃取（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水）得到5种萃取物，分别测定黄酮含量，并通过还原能力测定、DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力4种测定方法，对各萃取物抗氧化能力进行研究。结果显示，各提取物对Fe3+均有一定的还原能力，乙酸乙酯萃取物还原效果最为明显；定心藤不同极性部位均具有一定的抗氧化活性，乙酸乙酯萃取物抗氧化能力最强，DPPH·的半数清除浓度IC50为0.28mg/mL，羟自由基半数清除浓度IC50为0.41mg/mL，在0.2mg/mL浓度下，对超氧阴离子自由基的清除率达到42.88%，而其黄酮含量最高，达到609.96mg/g，这也许与它具有较高的抗氧化活性有关。说明乙酸乙酯萃取物具有较好的开发天然抗氧化剂的前景。

定心藤，不同极性部位，抗氧化活性，总黄酮

傣族“雅解”药中定心藤称为邓嘿罕，是“雅解”药多种单方或复方解药的重要药物之一，为茱萸科植物定心藤（Mappianthus iodioides Hand.Mazz）的干燥藤茎。据《傣药学》记载该药性凉，微苦，涩、平，祛风活络，消肿、解毒，用于风湿性腰酸腿痛，手足麻痹，跌打损伤等症［1］。相关研究表明，定心藤中含有黄酮、多糖、有机酸、强心苷、皂苷和鞣质等多种化学成分［2-5］，研究这些成分的药理活性作用，对开发定心藤类药物、保健品，促进我国民族医药的发展具有重要意义。

前人研究发现，定心藤中多糖及挥发性油类均具有一定的抗氧化活性［6-7］，而其总黄酮类提取物对DPPH具有较强的清除作用［8］，但对定心藤的抗氧化作用仅局限于从其活性成分的总类（如总多糖、总挥发油和总黄酮）上进行研究，具体是这些活性成分的何种结构或何部分物质起到主要抗氧化作用，目前还未见研究报道。

因此，本文专门采用五种极性溶剂对定心藤乙醇提取物进行萃取，获得五种不同的极性部分，通过比较各部分黄酮含量、清除DPPH自由基、羟自由基的能力和超氧阴离子自由基以及还原能力，比较各极性萃取物抗氧化能力，目的在于探讨定心藤抗氧化作用机理，为定心藤的进一步开发提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

定心藤2013年10月采自云南省普洱市柏枝寺，采集树龄5年的定心藤地上无损伤部分约1kg，经云南农业大学热带作物学院马晓老师鉴定为真品。样本切片，于60℃干燥后粉碎过40目筛，冷藏备用；芦丁标准品（HPLC≥98%） 购自上海士锋科技有限公司，20mg/瓶，产品批次：20140212；其他试剂均为国药集团分析纯。

FW-200万能粉碎机北京中兴伟业仪器有限公司；SK5210HP超声清洗仪上海科导超声仪器有限公司；UV759紫外-可见分光光度计上海精科仪器有限公司；AL204电子分析天平梅特勒-托利多公司；DZF-6053真空干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；EV321旋转蒸发仪莱伯泰科有限公司；HC-3018高速冷冻离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品制备取800g上述定心藤粉末，用8L 70%乙醇回流提取4h，过滤，滤渣重新用8L 70%乙醇回流提取两次，合并滤液，旋转蒸发仪减压蒸干得到31.215g提取物浸膏，浸膏用500mL去离子水分散溶解后，依次用600mL石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇各萃取三次，合并各部分萃取液，减压蒸干，得到定心藤醇提物的不同极性萃取物备用。

1.2.2定心藤不同极性萃取物黄酮含量的测定

1.2.2.1标准曲线绘制总黄酮含量的测定采用分光光度法，配制0.2mg/mL芦丁为标准溶液，分别取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00mL于25mL比色管中，加入1mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀后放置6min，然后加入1mL 10%硝酸铝溶液，摇匀后放置6min，再加入6mL 4%氢氧化钠溶液，用30%乙醇定容至刻度线［9］，摇匀，放置15min，于510nm测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.2黄酮含量的测定不同极性萃取物分别配制成浓度为0.5mg/mL的样品液，精确移取0.5mg/mL的各极性部位萃取液1mL，按照1.2.2.1的方法于510nm处测定其吸光度值，并利用回归方程计算各极性部位的黄酮含量。

1.2.3还原力的测定采用Galbe的方法［10］，不同极性萃取物配制10个浓度（0.025、0.1、0.15、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mg/mL）梯度样品液，取20mL的试管，加入3mL 0.2mol/L pH=6.6的磷酸缓冲溶液、2.5mL不同浓度样品液、2.5mL 1%铁氰化钾，摇匀后50℃水浴20min，快速冷却，加2.5mL质量浓度10%三氯乙酸，离心10min（3000r/min），取5mL上清液，分别加1mL 0.1%的三氯化铁，超纯水4mL，放置10min后，700nm测吸光度。以同等浓度的抗坏血酸作为阳性对照，进行实验。每一吸光度值平行测定3次，取平均值。

1.2.4清除羟自由基能力的测定参考陈留勇等的水杨酸法［11］，并略加改动。利用双氧水和亚铁离子混合产生羟自由基，再向反应液中加入水杨酸，使其反应产生有色化合物，在510nm处测定其吸光度值。实验时，不同极性萃取物配制13个浓度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mg/mL）梯度样品液，取1支20mL试管，依次加入样品液2mL、9mmol/L硫酸亚铁溶液2mL、0.1%双氧水溶液2mL，混匀静置10min，然后加入9mmol/L水杨酸2mL，混匀，37℃水浴反应30min，流水冷却，12000r/min离心6min，上清液在510nm处测定其吸光度值为A1；以蒸馏水代替双氧水得到的吸光度值为空白对照A0，以70%乙醇代替样品溶液作为本底液吸光度值A2，样品液对羟自由基的清除率：

K（%）=［1-（A1-A0）/A2］×100

以相同浓度的VC做阳性对照。每个样品平行测定3次，取平均值。

1.2.5超氧阴离子自由基清除能力的测定参照万军等的邻苯三酚自氧化法［12］。不同极性萃取物配制8个浓度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL）梯度样品液，取50mmol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL，加入3.2mL蒸馏水于试管中，放到25℃水浴中预热20min，分别加入1mL不同浓度的样品溶液，立即加入0.3mL 25℃水浴中预热的3mmol/L邻苯三酚，迅速混匀，然后放置于25℃水浴中精确反应4min，立即加入2滴8mol/L HCl终止反应，以蒸馏水代替样品溶液做空白实验，以10mmol/L HCl代替邻苯三酚溶液作为调零空白，320nm处测定各管的吸光度值，每个样品重复实验3次，取平均值，以VC做阳性对照，样品液对超氧自由基的清除率

K（%）=［（A0-A1）/A0］×100

式中，A0对照组吸光度值；Ai为样品组吸光度值。

1.2.6DPPH自由基清除能力的测定参考Tseng等的方法［13］，不同极性萃取物配制11个浓度（0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mg/mL）梯度样品液，取0.325mmol/L DPPH乙醇溶液2mL，加入2mL样品溶液，摇匀，在黑暗处放置20min，以无水乙醇为空白在517nm处测定其吸光度，每个样品平行测定3次，样品液对DPPH的清除率：

K（%）=｛1-［（A1-A3）/A2］｝×100

式中，A1：样品溶液2mL+DPPH液2mL溶液的吸光度；A2：DPPH液2mL+无水乙醇2mL溶液的吸光度；A3：样品液2mL+无水乙醇0.5mL溶液的吸光度。

1.3数据处理

采用Excel统计软件进行数据处理与作图，以上测定均重复三次，图中数据均为三次重复平均值加标准差。

2　结果与分析

2.1定心藤乙醇提取物不同极性部分的黄酮含量比较

图1　芦丁的标准曲线Fig.1　The standard curve of rutin

由图1可知，芦丁溶液质量浓度x（mg/mL）与y（吸光度值A）的回归方程：y=12.559x+0.0034，相关系数R2=0.9996，线性范围为0.008～0.056mg/mL。

图2　定心藤乙醇提取物不同极性部分的黄酮含量Fig.2　Total flavonoids contents of different polar fraction from ethanol extract of Mappianthus iodioides

定心藤不同极性部位黄酮含量如图2所示。由图2可以看出，乙酸乙酯相中黄酮类物质明显高于其他各极性部位，达到609.96mg/g，而在氯仿相（260.00mg/g）和正丁醇相（311.03mg/g）中黄酮类也明显多于其他两种溶剂，水相中存在的黄酮类物质较少，为150.1mg/g，石油醚相中黄酮类化合物最少，仅为118.92.96mg/g。测定表明，黄酮类化合物在极性溶剂中的溶解度顺序为：乙酸乙酯相＞正丁醇相＞氯仿相＞水相＞石油醚相。

2.2定心藤乙醇提取物不同极性部分的还原力测定

抗氧化剂的活性与其还原能力存在密切的联系，抗氧化剂通过提供电子使具有氧化活性的自由基还原而达到清除自由基的效果，所以其还原力越强，则抗氧化活性越高。因此可以根据还原力的大小判断抗氧化剂活性的强弱［14］。如图3所示，在实验测定范围内各极性部位实验样品浓度与还原力呈正相关，随着试液浓度增大，还原力均不断增强，表明定心藤各极性萃取物均具有一定的还原力，但是，在同等浓度下，它们的还原能力始终弱于VC。根据图3，在低浓度范围内，乙酸乙酯相与其他萃取相的还原能力差异不大；但随着浓度的逐渐增加，乙酸乙酯相的还原能力明显高于其他相，还原能力顺序为：乙酸乙酯相＞正丁醇相＞氯仿相＞水相＞石油醚相。

图3　定心藤乙醇提取物不同极性部分的还原能力（n=3）Fig.3　Reducing power of different polar fraction from ethanol extract of Mappianthus iodioides（n=3）

2.3定心藤乙醇提取物不同极性部分的DPPH自由基清除能力比较

DPPH可以在有机溶剂中形成稳定的自由基，呈紫红色，在517nm处有强吸收。当存在自由基清除剂时，由于自由基清除剂与其单电子配对而使其吸收消失，其褪色程度与所接受的电子数成定量关系［15］。定心藤不同极性醇提物和VC对DPPH·的清除作用结果见图4。由图4可知，定心藤各极性部位均表现出较强的DPPH·的清除能力，尤其是乙酸乙酯相，在0.5mg/mL的浓度下，对DPPH·清除作用可以达到同等VC浓度的77%。经过实验得出DPPH·被清除一半时各极性部位的所需的浓度（IC50）分别为石油醚相0.94mg/mL、氯仿相0.44mg/mL、乙酸乙酯相0.28mg/mL、正丁醇相0.49mg/mL、水相0.87mg/mL。

图4　定心藤乙醇提取物不同极性部分的DPPH自由基清除能力（n=3）Fig.4　Scavenging DPPH·activities of different polar fraction from ethanol extract of Mappianthus iodioides（n=3）

2.4定心藤乙醇提取物不同极性部分的超氧阴离子自由基清除能力比较

超氧阴离子自由基是生物体内较稳定的一类自由基，通常可以与其他物质反应产生其他自由基，从而对生物体产生伤害［16］。定心藤各极性部位对超氧阴离子自由基的清除作用见图5。由图5中可以看出，定心藤各极性部位表现出的清除超氧阴离子自由基的能力差异较大，其中乙酸乙酯部分清除能力最强，在0.2mg/mL浓度下，其对超氧阴离子自由基的清除率达到42.88%，而正丁醇部分为33.42%，水相部分为20.75%，氯仿部分为20.64%，石油醚部分仅为9.12%，说明乙酸乙酯部分对超氧阴离子的清除作用最好，石油醚部分最差。与VC相比较，在0.2mg/mL浓度下，乙酸乙酯部分对超氧阴离子自由基等清除作用大约为VC的59.5%。

图5　定心藤乙醇提取物不同极性部分的超氧阴离子自由基清除能力（n=3）Fig.5　Scavenging superoxide anion free radical activities of different polar fraction from ethanol extract of Mappianthus iodioides（n=3）

2.5定心藤乙醇提取物不同极性部分的羟自由基清除能力比较

图6　定心藤乙醇提取物不同极性部分的羟自由基清除能力（n=3）Fig.6　Scavenging hydroxyl free radical activities of different polar fraction from ethanol extract of Mappianthus iodioides（n=3）

羟自由基对生物组织危害性较强，其会导致细胞膜系统氧化损伤，进而影响膜的流动性，使膜通透性升高，引起膜内物质外泄。羟自由基也会使生物体内生物大分子氧化，对生命活动产生危害［17-18］。定心藤不同极性部位对羟自由基的清除能力如图6所示。由图6中可知，定心藤不同极性部位均具有一定的清除羟自由基的能力，且有明显的量效关系，其中乙酸乙酯清除羟自由基能力最强，在2.0mg/mL浓度下，清除率大小顺序为乙酸乙酯相＞正丁醇相＞氯仿相＞水相＞石油醚萃相；在此浓度下，与阳性对照VC相比，乙酸乙酯相、氯仿相、正丁醇相、水相、石油醚相对羟自由基的清除率分别为VC的95.2%、60.63%、61.6%、41.9%、32.6%，即乙酸乙酯部分对超氧阴离子自由基的清除能力与VC大体相当，其他极性部位的清除能力弱于VC。

3　结论

定心藤乙醇提取物的不同极性萃取物抗氧化实验结果表明，不同极性萃取物均具有抗氧化活性，其中以乙酸乙酯相抗氧化能力最强，其次是氯仿相和正丁醇相，最弱的为水相及石油醚相，这与黄酮类化合物在各极性部位的分部相一致，从而说明黄酮类化合物可能是定心藤中抗氧化活性的主要成分。

乙酸乙酯极性部位相对于其他极性部位表现出较强的还原能力和清除自由基的能力，可以作为定心藤抗氧化活性成分研究的主要极性部位进行深入研究。本实验为从定心藤中提取分离有效成分提供一定思路参考，并为进一步探讨定心藤的抗氧化机制提供了一定的理论基础，也为定心藤进一步资源化利用和相关产品的开发提供了技术支撑。

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Study on antioxidative activities in vitro of different polarity fractions of ethanol extract from Mappianthus iodioides Hand.Mazz

LI Wei-feng1，WANG Ya-ling1，GUO Fen1，GAO Yun-tao2，*
（1.Faculty of Tropical Crops，Yunnan Agricultural University，Puer 665000，China；2.School of Chemistry and Biotechnology，Yunnan Nationalities University，Kunming 650031，China）

To investigate the antioxidant activities in vitro of different polarity fractions of 75%ethanol extract from Mappianthus iodioides，five polarities of extracts were obtained by using different polarity solvents，such as petroleum，chloroform，ethyl acetate，normal butyl alcohol and water.The content of flavonoids was detected by absorption spectroscopy.Their antioxidant activities were evaluated by reduction energy capability and scavenging capability of DPPH，hydroxyl free radical and superoxide anion free radical.The results showed that all of the extracts had strong deoxidization ability of Fe3+.Ethyl acetate extracts had significant deoxidization ability.All the different polarity fractions of extract antioxidant activities were observed，of which the ethyl acetate extract had highest antioxidant activity，and 50%inhibitory concentration（IC50）of DPPH of the ethyl acetate extract was 0.28mg/mL，50%inhibitory concentration（IC50）of·OH of the ethyl acetate extract was 0.41mg/mL.When the concentration of the ethyl acetate extract reached to 0.2mg/mL，O2-·scavenging rate was 42.88%.In addition，total flavonoids content of ethyl acetate extract was significantly higher than that of others，reached to 609.96mg/g，which might related with its higher antioxidant activity.It was indicated that ethyl acetate extract of 75%ethanol extract from Mappianthus iodioides had good development potential for natural antioxidant.

Mappianthus iodioides；different polarity fractions；antioxidant activity；total flavones

TS255.1

A

1002-0306（2015）14-0107-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.012

2014－11－18

李维峰（1981-），男，硕士，讲师，主要从事天然产物化学方面的研究。

高云涛（1962-），男，教授，主要从事分析科学与技术方面的研究。

云南省教育厅科学研究基金一般项目（2013Y536）。