重组人色素上皮衍生因子对HaCaT细胞体外增殖和白细胞介素6、8及血管内皮生长因子表达的影响

李小琼 魏志平 刘彦群

·研究报道·

重组人色素上皮衍生因子对HaCaT细胞体外增殖和白细胞介素6、8及血管内皮生长因子表达的影响

李小琼 魏志平 刘彦群

目的 探讨重组人色素上皮衍生因子（rhPEDF）对HaCaT细胞体外增殖和白细胞介素6（IL-6）、IL-8及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法 HaCaT细胞分4组进行不同处理，分别为100 μg/L rhPEDF组、50 μg/L rhPEDF组、25 μg/L rhPEDF组及对照组（只加RPMI 1640培养液）。采用CCK8法检测不同浓度rhPEDF作用于HaCaT细胞24、48、72 h后对细胞体外增殖的影响。RT-PCR和Western印迹法检测rhPEDF对HaCaT细胞IL-6、IL-8、VEGF mRNA及其蛋白表达的影响。统计分析方法采用两因素方差分析、单因素方差分析、SNK-q检验以及Pearson相关分析。结果 25、50、100 μg/L的rhPEDF作用24、48、72 h后对HaCaT细胞体外增殖均有不同程度的抑制作用。随时间延长和rhPEDF浓度的增加，rhPEDF对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用均逐渐增强（F=1115、329.9，均P＜0.001）。与对照组相比，不同浓度（100、50、25 μg/L）rhPEDF作用于HaCaT细胞48 h后，VEGF、IL-6、IL-8 mRNA及蛋白的表达均下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。随rhPEDF浓度的增加，各浓度rhPEDF组VEGF mRNA、IL-6和IL-8蛋白表达均出现下调，与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；100 μg/L rhPEDF组的IL-6、IL-8 mRNA表达明显低于25 μg/L rhPEDF组（P＜0.05）；100 μg/L rhPEDF组 VEGF蛋白表达分别低于 50、25 μg/L rhPEDF组（P＜0.05），而 50与25 μg/L rhPEDF组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 rhPEDF可抑制HaCaT细胞体外增殖，并可在mRNA及蛋白水平下调IL-6、IL-8、VEGF的表达。

角蛋白细胞；白细胞介素8；白细胞介素6；血管内皮生长因子类；银屑病；色素上皮衍生因子；HaCaT细胞

色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的一员，具有神经保护作用，能够抑制多种肿瘤细胞及内皮细胞增殖，诱导凋亡，抑制血管新生［1］。在膀胱癌及前列腺癌的研究中发现，PEDF与白细胞介素 8（IL-8）的表达呈负相关，表现出抗炎作用［2-3］。Nakamura等［4］在最近的研究中发现，银屑病患者血清中PEDF与IL-6呈负相关。Abe等［5］首次报告，PEDF源性肽能减轻银屑病小鼠模型的棘层增厚和血管新生。本实验研究了重组人色素上皮衍生因子（rhPEDF）对HaCaT细胞体外增殖和 IL-6、IL-8、血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，探讨PEDF在银屑病发病机制中的作用。

一、材料与方法

1.细胞与试剂：人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞（上海复祥生物科技有限公司），rhPEDF（美国Peprotech公司），RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），兔抗人IL-6、IL-8单克隆抗体（美国bioworld公司），兔抗人VEGF单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），鼠抗人β肌动蛋白单克隆抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司），碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG，马抗小鼠IgG抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），BCA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），RT-PCR引物设计［生工生物工程（上海）股份有限公司］，逆转录及PCR试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］。

2.细胞培养及实验分组：HaCaT细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃5%CO2饱和湿度培养箱中培养，待细胞长满瓶底后，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，接种于培养瓶内，置培养箱中培养24 h贴壁后，更换无血清、无双抗RPMI 1640培养液，并加入不同浓度rhPEDF。HaCaT细胞分为4 组，分别为 100 μg/L rhPEDF 组、50 μg/L rhPEDF 组、25 μg/L rhPEDF组及只加RPMI 1640培养液的对照组。

3.CCK8法检测HaCaT细胞体外增殖：取HaCaT细胞6×103个/ml接种于96孔培养板，每孔100μl，培养24h，细胞贴壁后，按上述实验分组分别加入不同浓度rhPEDF。每组设6个复孔，分别培养24、48、72 h后终止培养，弃去原培养基，将无血清、无双抗RPMI 1640培养液与CCK8试剂按10∶1比例混匀，每孔加入100 μl，于培养箱中孵育2 h，酶标仪测定450 nm波长处每孔的吸光度（A值）。实验重复3次。细胞增殖抑制率=（1－给药组A值/对照组A值）×100%。

4.RT-PCR法检测HaCaT细胞IL-6、IL-8、VEGF mRNA表达：实验分组同上，培养24 h后提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。目的基因IL-6上游引物：5′-ATTCCTTCTTCTGG TCAGAAACC-3′，下游引物：3′-ACAAAGGATATTCAAACTG CATAGC-5′，扩增片段为 205 bp；IL-8 上游引物：5′-TCTTGG CAGCCTTCCTGATTT-3′，下游引物：5′-CTGGCATCTTCACTG ATTCTTGG-3′，扩增片段为 320 bp；VEGF 上游引物：5′-CATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3′，下游引物：5′-GGTCTGC ATTCACATTTGTTGT-3′，扩增片段为396 bp；内参β肌动蛋白上游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，扩增片段为241 bp。采用逆转录试剂盒将其逆转录得到cDNA。PCR反应体系为25 μl，扩增条件为94℃预变性3 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后 72℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统扫描拍照，检测各电泳条带的灰度值，计算与β肌动蛋白比值，得到目的产物的相对含量。

5.Western印迹法检测HaCaT细胞IL-6、IL-8及VEGF的表达：实验分组同上，培养48 h后收集细胞，提取总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，上样80 μg进行电泳、转膜及封闭，一抗孵育（兔抗人IL-6、IL-8单克隆抗体滴度为1∶1 000；兔抗人VEGF单克隆抗体为1∶200，鼠抗人β肌动蛋白单克隆抗体为1∶500），4℃过夜，二抗孵育（山羊抗兔IgG抗体的工作滴度为 1∶500；马抗小鼠 IgG 抗体为 1∶500）2 h，BCIP/NBT显色液显色，凝胶成像系统观察结果，目的蛋白条带IL-6、IL-8、VEGF与相应内参β肌动蛋白条带的灰度值比值作为其蛋白表达的半定量指标。

6.统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件，计量资料用±s表示。分析rhPEDF对HaCaT细胞体外增殖的影响随时间和浓度变化的趋势采用两因素方差分析；多个均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；相关分析用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.rhPEDF 对 HaCaT 细胞增殖的影响：25、50、100 μg/L的rhPEDF作用24、48、72 h后对HaCaT细胞增殖均有不同程度的抑制。随时间延长，抑制作用逐渐增强（F=1 115.000，P<0.001）；随rhPEDF浓度增加，抑制作用也逐渐增强（F=329.900，P<0.001）；时间和浓度之间存在交互作用（F=72.148，P<0.001），说明时间因素的变化趋势随rhPEDF浓度不同而不同。见表1。

2.rhPEDF对 HaCaT细胞 IL-6、IL-8、VEGF mRNA 及其蛋白表达的影响：与对照组相比，不同浓度rhPEDF作用于HaCaT细胞48 h后，VEGF、IL-6、IL-8 mRNA 及蛋白的表达均下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。随rhPEDF浓度的增加，VEGF mRNA、IL-6和IL-8蛋白均出现下调，差异均有统计学意义 （P<0.05）；100 μg/L rhPEDF 组的 IL-6、IL-8mRNA 表达明显低于 25 μg/L rhPEDF 组（P ＜ 0.05）；100 μg/L rhPEDF组VEGF蛋白表达分别低于50、25 μg/L rhPEDF组（P＜0.05），而在50和25 μg/L rhPEDF组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 重组人色素上皮衍生因子（rhPEDF）作用于HaCaT细胞不同时间对增殖抑制率的影响（%± s，n=3）

表1 重组人色素上皮衍生因子（rhPEDF）作用于HaCaT细胞不同时间对增殖抑制率的影响（%± s，n=3）

组别 24 h 48 h 72 h 100 μg/L rhPEDF 26.33±2.11 37.65±2.36 50.19±1.09 50 μg/L rhPEDF 19.32±2.46 27.82±0.87 41.92±3.01 25 μg/L rhPEDF 13.96±1.49 19.37±2.50 35.62±1.90

表2 重组人色素上皮衍生因子（rhPEDF）对HaCaT细胞白细胞介素6和8、血管内皮生长因子（VEGF）及其mRNA表达的影响（± s，n=3）

表2 重组人色素上皮衍生因子（rhPEDF）对HaCaT细胞白细胞介素6和8、血管内皮生长因子（VEGF）及其mRNA表达的影响（± s，n=3）

注：不同浓度rhPEDF组白细胞介素6和8、VEGF及其mRNA相对表达量分别与对照组相比，均P＜0.05

组别 白细胞介素6 白细胞介素8 VEGF mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白100 μg/L rhPEDF 0.411±0.098 0.637±0.022 0.551±0.049 0.411±0.015 0.507±0.109 0.428±0.082 50 μg/L rhPEDF 0.567±0.066 0.761±0.038 0.700±0.073 0.501±0.015 0.695±0.027 0.700±0.091 25 μg/L rhPEDF 0.755±0.048 0.939±0.049 0.763±0.071 0.695±0.039 0.874±0.063 0.838±0.093对照组 1.031±0.197 1.153±0.007 0.974±0.129 0.848±0.021 1.035±0.059 1.106±0.071 F值 15.436 165.000 12.441 169.834 30.300 36.627 P值 0.001 ＜0.001 0.002 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

三、讨论

PEDF在人体中分布广泛，具有抗增殖、抗血管新生、抗炎等作用，现已成为肿瘤及血管新生、炎症性相关疾病治疗的新靶点［1］。银屑病是慢性炎症性皮肤病，其组织病理学特征包括角质形成细胞过度增殖，角化不全，表皮内中性粒细胞浸润，真皮乳头血管增生、迂曲等［6］。Li等［7］的研究表明，rhPEDF对HaCaT细胞体外增殖具有抑制作用，并发现VEGF165能够促进HaCaT细胞PEDF的表达。本实验结果也证明，rhPEDF对HaCaT细胞的增殖具有显著抑制作用。

PEDF不仅能够抑制多种细胞增殖，还是重要的血管生长抑制因子［1］。微血管生成异常与银屑病的发生发展、持续存在及复发有密切关系，VEGF是新血管生成不可缺少的诱导因子［8］。银屑病皮损中大量增殖的角质形成细胞分泌VEGF，并能促进角质形成细胞分泌较多的促炎因子如IL-6和IL-8［9］。研究发现，PEDF能抑制肿瘤细胞及血管内皮细胞VEGF的表达［1］，而PEDF源性肽能抑制银屑病小鼠模型的血管新生［5］，推测PEDF通过抑制角质形成细胞VEGF表达，进而抑制银屑病的血管新生。本实验结果也显示，随着rhPEDF浓度增高，HaCaT细胞中VEGF mRNA和蛋白表达逐渐下调。

在糖尿病视网膜疾病的研究中发现，PEDF不仅抑制VEGF的表达，而且抑制TNF-α、IL-6等炎症因子的表达，表现出抗炎作用［10］。Hirsch 等［3］的研究表明，PEDF 能够通过抑制前列腺癌细胞中IL-8的表达，达到抗炎及抗增殖作用。Nakamura等［4］认为，PEDF可能在银屑病发病机制中发挥抗炎作用。银屑病皮损角质形成细胞通过分泌多种细胞因子参与局部免疫反应，如IL-8参与中性粒细胞聚集及脓肿的形成，诱导炎症反应［11］。研究表明，银屑病皮损局部及外周血中IL-6、IL-8表达均增高，高表达的IL-6、IL-8又能促进角质形成细胞的增生［11-12］。因此，抑制银屑病角质形成细胞炎症因子的表达，对抑制炎症反应有重要作用。本实验结果表明，rhPEDF能够抑制HaCaT细胞IL-6、IL-8 mRNA和蛋白的表达。

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Effects of recombinant human pigment epithelium derived factor onin vitroproliferation of and expressions of interleukin-6,-8 and vascular endothelial growth factor in cultured human HaCaT keratinocytes

Li Xiaoqiong,Wei Zhiping,Liu Yanqun.Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221002,Jiangsu,China

ObjectiveTo investigate the effects of recombinant human pigment epithelium derived factor（rhPEDF）onin vitroproliferation of and expressions of interleukin 6（IL-6）,IL-8 and vascular endothelial growth factor（VEGF）in cultured human HaCaT keratinocytes.MethodsSome cultured HaCaT cells were treated with rhPEDF at various concentrations（25,50,100 μg/L）for different durations,and some treated with RPMI 1640 medium only served as the control group.Cell counting kit-8（CCK8）assay was performed to evaluate cell proliferation after 24-,48-and 72-hour treatment,reverse transcription （RT）-PCR to measure the mRNA expressions of IL-6,IL-8 and VEGF in HaCaT cells after 24-hour treatment,and Western blot to detect the protein expressions of IL-6,IL-8 and VEGF in HaCaT cells after 48-hour treatment.Statistical analysis was carried out by two-and one-way analysis of variance,Student-Newman-Keuls（SNK）-qtest and Pearson correlation analysis.ResultsAfter treatment with rhPEDF of 25－100 μg/L for 24 － 72 hours,the proliferation of HaCaT cells was significantly inhibited to different extents compared with the control group（all P ＜ 0.05）,and the inhibition rate significantly increased with the increase in treatment duration and concentrations of rhPEDF（F=1115,329.9,respectively,bothP ＜ 0.001）.Moreover,there was a significant decrease in the expressions of IL-6,IL-8 and VEGF mRNAs（at 24 hours）and proteins（at 48 hours）in HaCaT cells after treatment with rhPEDF of 25 － 100 μg/L compared with the control group（allP ＜ 0.05）.The expression levels of VEGF mRNA as well as IL-6 and IL-8 proteins all significantly decreased with the increase of rhPEDF concentrations （allP ＜ 0.05）.The mRNA expressions of IL-6 and IL-8 were significantly lower in the 100-μg/L rhPEDF group than in the 25-μg/L rhPEDF group（bothP ＜ 0.05）,and the protein expression of VEGF was significantly weaker in the 100-μg/L rhPEDF group than in 25-and 50-μg/L rhPEDF groups （bothP ＜ 0.05）,but similar between the 25-and 50-μg/L rhPEDF groups （P ＞ 0.05）.ConclusionsrhPEDF can inhibit the proliferation of HaCaT cells,and down-regulate the mRNA and protein expressions of IL-6,IL-8 and VEGF.

Keratinocytes;Interleukin-8;Interleukin-6;Vascular endothelial growth factors;Psoriasis;Pigment epithelium derived factor;HaCaT cells

Wei Zhiping,Email:xzwzp1961@aliyun.com

作者单位：221002江苏，徐州医学院附属医院皮肤科

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.015

魏志平，Email：xzwzp1961@aliyun.com

2014-10-24）

（本文编辑：周良佳 颜艳）