药疹患者外周血单一核细胞中巨细胞病毒的检测

李双庚 陈官芝 肖君刚 王君 潘敏

药疹患者外周血单一核细胞中巨细胞病毒的检测

李双庚 陈官芝 肖君刚 王君 潘敏

目的 探讨人巨细胞病毒（CMV）感染在药疹发病中的作用。方法 收集44例药疹患者（其中重型药疹13例）及50例健康对照外周血，Taqman实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测外周血单一核细胞中CMV DNA阳性率及载量；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清CMV IgM阳性率。结果 44例药疹患者CMV DNA阳性率（65.91%，29/44例）高于健康对照组（28.00%，14/50例），差异有统计学意义（χ2=13.552，P<0.05）；重型药疹患者（11/13例）、轻型药疹患者（58.06%，18/31例）及健康对照组CMV DNA阳性率不完全相等（χ2=16.153，P<0.05），其中重型组高于轻型组（χ2=13.817，P<0.05）及对照组（χ2=7.237，P<0.05）；药疹患者CMV DNA载量（28 183.829±19 527.654）拷贝高于健康对照组（3 019.952±1 760.952）拷贝，差异有统计学意义（t′=8.517，P<0.05），重型药疹患者（554 813.389 ± 722 642.498）拷贝、轻型药疹患者（13 290.558±14 082.356）拷贝与对照组间CMV DNA载量差异无统计学意义（P>0.05）。药疹患者CMV IgM阳性率（13.64%，6/44例）与健康对照组（6.00%，3/50例）差异无统计学意义（P>0.05）；轻型药疹（6.45%，2/31例）、重型药疹（4/13例）及健康对照组各组均数不完全相等（χ2=7.832，P<0.05），其中重型组高于对照组（χ2=6.409，P<0.05）。结论 药疹患者存在CMV感染，CMV感染可能是药疹发病或加重的因素之一。

药疹；巨细胞病毒；巨细胞病毒感染

2.主要试剂：全血DNA提取试剂盒购于北京百泰克生物技术有限公司，pMD18-T载体、E.coliCompetent Cell JM109、Hind III限制酶、EASY Dilution购于宝生物工程（大连）有限公司，HotMaster PCR MasterMix购于北京天根生化科技有限公司，Taqman荧光定量PCR试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司，CMV IgM ELISA试剂盒购于德国IBL公司。

3.引物及探针序列：参照文献［8］设计CMV特异性引物和探针，由宝生物工程（大连）有限公司合成，CMV上游引物序列：5′-AACTCAGCCTTCCCTAAGACCA-3′，探针序列：5′-FAM-CAATGGCTGCAGTCAGGCCATGG-TAMRA-3′，下游引物序列：5′-GGGAGCACTGAGGCAAGTTC-3′，扩增产物 76 bp。

4.标本制备：采集药疹患者急性期（发疹2～7 d）与健康对照晨起空腹静脉血3 ml EDTA抗凝，提取外周血单一核细胞DNA，操作方法按试剂盒说明书进行，-20℃保存备用。同时采集药疹患者与健康对照晨起空腹静脉血3 ml，分离血清，-80℃保存用于ELISA。实验所需的DNA阳性对照来自CMV B189病毒株，由青岛大学医学院张文卿教授惠赠。

5.方法：实时荧光定量PCR测定外周血单一核细胞CMV DNA阳性率及载量：反应体系为25 μl，含2×HotMaster PCR混合物 12.5 μl，上下游引物（20 μmol/L）各 1 μl，模板（CMV B189 病毒株 DNA）2 μl，ddH2O 8.5 μl。反应条件为 95 ℃预变性30 s；然后 95℃ 5 s，57℃ 30 s，共40个循环；最后 72℃延伸5 min。每份标本均做3次重复实验取均值。反应结束后取PCR产物于2%琼脂糖凝胶进行电泳（100 V，40 min），凝胶电泳扫描系统观察电泳结果，证实为CMV及其特异性片段。

重组质粒克隆及质粒线性化：PCR扩增产物连接pMD-18-T载体后转化入E.coliJM109感受态细胞内，37℃培养过夜（用X-gal/IPTG/Amp＋LB平板）得到大量转化子；提取质粒DNA模板，用HindⅢ限制酶进行线性化处理，PCR抽提、乙醇精制后得到标准品DNA。观察标准品DNA电泳结果及测定A值。产物测序所得序列与基因库比对，结果表明扩增片段重组后无变异发生。

实时荧光定量PCR检测临床标本：将构建的CMV标准品 DNA（107拷贝/μl）用 EASY Dilution 按 10 倍梯度稀释（0、101、102、103、104、105倍）作为模板，进行实时 PCR 反应，制作标准曲线，并对临床标本进行检测。反应体系为20 μl，含2 × GoldStar TaqMan Mixture 10 μl，上下游引物（20 μmol/L）各 0.4 μl，探针 0.8 μl，模板 2 μl，RNase 淡水 6.4 μl。反应条件为95℃预变性30 s；然后95℃ 5 s，57℃ 30 s，共40个循环；最后72℃延伸5 min。每份标本均做3次生物学重复实验，每次实验设阳性对照及阴性对照，阴性对照用RNase-淡水替换模板DNA。反应结束后取PCR产物于2%琼脂糖凝胶进行电泳，得到预期扩增片段。

PCR复制效率、检测的准确性及重复性：构建的标准品DNA可以得到较好的扩增曲线、标准曲线。CMV标准曲线相关系数0.993，扩增效率0.908，可以在较宽的范围内进行准确定量，且3个平行样品重复性好。

ELISA法检测血清CMV IgM阳性率：参照试剂盒说明书进行，每份标本均做3个复孔。

6.统计学方法：SPSS19.0软件进行统计处理，定量检测结果以±s表示，2组间均数比较采用t′检验，3组间均数比较采用秩和检验；定性数据用率表示，组间率的比较采用χ2检验。

二、结果

1.CMV DNA阳性率检测：44例药疹患者CMV DNA阳性率为 65.91%（29/44），健康对照组为 28.00%（14/50），两组比较差异有统计学意义（χ2=13.552，P<0.05）。重型患者（11/13例）、轻型患者（58.06%，18/31例）、健康对照组CMV DNA阳性率依次递减，各组总体率不等或不完全相等（χ2=16.153，P<0.05），其中重型组高于轻型组（χ2=13.817，P<0.0167）及对照组（χ2=7.237，P<0.0167），见表 1。

2.CMV DNA载量检测：44例药疹患者CMV DNA载量拷贝高于健康对照组拷贝，差异有统计学意义（t′=8.517，P<0.05）；重型药疹患者拷贝、轻型药疹患者拷贝、健康对照组CMV DNA载量依次递减，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。

3.药疹患者组与健康对照组CMV特异性IgM检测：药疹患者CMV IgM阳性率（13.64%，6/44例）与健康对照组（6.00%，3/50例）差异无统计学意义（P>0.05）；轻型药疹（6.45%，2/31例）、重型药疹（4/13例）及健康对照组各组均数不完全相等（χ2=7.832，P<0.05），其中重型组高于对照组（χ2=6.409，P<0.0167），见表 1。

表1 药疹患者与健康对照CMV DNA及CMV IgM检测（例）

三、讨论

CMV又名人疱疹病毒5型（HHV-5），可引起感染细胞形成巨细胞，能在唾液腺、肾和单核吞噬细胞系统中建立潜伏感染，与HHV-6及HHV-7同属β疱疹病毒亚科，基因组具有同源性，抗原性亦有部分交叉，宿主范围窄，生长周期长［9］。有报道，药疹的发生与病毒感染有关，特别是人疱疹病毒和人免疫缺陷病毒［1］。LeClaire 等［10］报道的传染性单核细胞增多症患者使用氨苄西林等抗生素治疗，常导致全身性麻疹样皮疹，当传染性单核细胞增多症急性期消退后再用这些药物治疗，患者麻疹样皮疹不复发。Kano等［5］研究发现，药物超敏反应综合征患者症状于停用病因药物之后仍持续发展并转为迁延化，原因除了特定的药物及遗传因素之外，此类患者体内存在潜伏感染病毒的再激活，主要是人疱疹病毒。

本文结果显示，药疹患者组CMV DNA阳性率及病毒载量高于健康对照组；与健康对照比较，CMV DNA阳性率有随药疹病情加重升高趋势，提示CMV感染可能与药疹有关，CMV可能为导致药疹发病或加重的一个危险因素。但CMV DNA载量无论在重型药疹患者、轻型药疹患者及健康对照组间差异无统计学意义，推测CMV感染参与药疹的发生发展可能并不需要较高的病毒量维持。

特异性IgG和IgM检测是区分CMV潜伏感染和活动性感染最为常用的指标。药疹患者血清中病毒特异性抗体的测定作为研究病毒与药疹关系的有效手段已被国外学者广泛应用，CMV特异性IgM抗体的出现提示活动性CMV感染。本文结果显示，重型药疹患者组IgM阳性率明显高于健康对照组，提示药疹患者特别是重型药疹患者可能存在活动性CMV感染。

总之，CMV原发感染后可在体内长期潜伏，一定条件下可被激活，导致机体免疫系统功能紊乱，可能成为药疹的促发因素加快疾病的发展进程。本文结果提示：药疹患者中存在CMV的活动性感染和DNA阳性率及病毒载量增加，CMV感染可能是影响药疹发病及加重的环境因素之一。

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Detection of cytomegalovirus in peripheral blood mononuclear cells of patients with drug eruptions

Li Shuanggeng,Chen Guanzhi*,Xiao Jungang,Wang Jun,Pan Min.*Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China

Chen Guanzhi,Email:chenguanzhi@outlook.com

Objective To investigate the role of human cytomegalovirus （CMV）in the occurrence of drug eruptions.Methods Peripheral blood samples were collected from 44 patients with drug eruptions（including 13 severe cases） and 50 healthy human controls.Taqman fluorescent real-time quantitative PCR （RT-PCR） was performed to determine the positive rate and load of CMV DNA in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to detect anti-CMV IgM antibodies in sera.Results The positive rate of CMV DNA was significantly higher in the patients than in the controls（65.91% （29/44）vs.28.00%（14/50）,χ2=13.552,P<0.05）,significantly different among patients with severe drug eruptions（11/13）,patients with mild drug eruptions（58.06%（18/31））and the controls（χ2=16.153,P<0.05）.In addition,patients with severe drug eruptions showed a higher positive rate of CMV DNA compared with patients with mild drug eruptions（χ2=13.817,P<0.05）and the controls（χ2=7.237,P<0.05）.CMV DNA load was significantly higher in the patients than in the controls（（28 183.829 ± 19 527.654）vs.（3 019.952 ± 1 760.952）copies,t′=8.517,P<0.05）.No significant difference was found in CMV DNA load between patients with severe drug eruptions（（554 813.389 ± 722 642.498）copies）,patients with mild drug eruptions （（13 290.558 ± 14 082.356）copies））and the controls（P>0.05）.The positive rate of anti-CMV IgM antibodies was similar between the patients and controls（13.64%（6/44）vs.6.00%（3/50）,P>0.05）,but significantly different among patients with severe drug eruptions（4/13）,patients with mild drug eruptions（6.45%,2/31）and the controls（χ2=7.832,P<0.05）,and significantly higher in patients with severe drug eruptions than in the controls （χ2=6.409,P<0.05）.Conclusions CMV infection exists in patients with drug eruptions,and might be a factor associated with the initiation and aggravation of drug eruptions.

Drug eruptions;Cytomegalovirus;Cytomegalovirus infections

我们前期研究［1-3］结果表明，EB病毒和人类疱疹病毒6型及7型（HHV-6，HHV-7）感染与药疹的发生相关。近年来药疹的病毒感染因素受到重视，活动性病毒感染可改变机体的免疫调节功能，增加免疫系统的敏感性［4］。有学者发现，在药物超敏反应综合征患者中，可以观察到人类疱疹病毒的激活增殖［5］。这些病毒在体内可互相关联，一种病毒的激活复制可导致其他病毒的激活复制［6］。我们用Taqman实时荧光定量PCR检测外周血单一核细胞中巨细胞病毒（CMV）DNA阳性率及载量，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测定血清CMV IgM阳性率，探讨CMV感染在药疹发生中的作用。

一、对象与方法

1.临床资料：2011年9月至2013年7月青岛大学附属医院、青岛市胶州中心医院皮肤科门诊和住院药疹患者44例，其中女20例，男24例，年龄17～63岁，平均（40.79±17.72）岁。所有患者均有明确的服药史，在服药后2 h至7 d（平均4.03 d）出现皮疹，符合药疹的诊断和分型标准［7］。其中重型药疹13例，包括超敏反应综合征1例、Steven-Johnson综合征2例、大疱性表皮松解型4例、剥脱性皮炎型6例。轻型药疹31例，包括固定型、麻疹型或猩红热型、荨麻疹型、多形红斑型等临床常见类型。致敏药物有：青霉素或头孢类17例，占38.64%；磺胺类3例，占6.82%；解热镇痛药11例，占25.00%；抗癫痫药5例，占11.36%；别嘌醇1例，占2.27%；中药或中成药7例，占15.91%。选择同期体检者50例作为健康对照组，其中男、女各25例，年龄18～68岁，平均（41.96±15.17）岁，两组性别和年龄差异无统计学意义（均P>0.05）。本研究通过青岛大学附属医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.020

青岛市公共领域科技支撑计划项目（09-1-1-24-nsh）

266003青岛大学附属医院皮肤科［李双庚（现在青岛市胶州中心医院皮肤科，266300）、陈官芝、肖君刚、王君、潘敏］

陈官芝，Email：chenguanzhi@outlook.com

2014-05-20）

（本文编辑：吴晓初）