“一测多评”法同步测定大黄中五种蒽醌类成分的含量

广西桂林食品药品检验所（541002）覃晓 周文杰 李夏林

附图 混合对照品(左)及样品图谱(右)

大黄为蓼科植物掌叶大黄R h e u m p a l m a t u m L.、唐古特大黄R h e u m tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根和根茎[1]。是临床上用量较大的一味药，其主要活性成分为大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚等。2010版药典在用高效液相色谱法对这5种成分的含量进行测定时，需要用到5种对照品，而中药对照品通常都较贵，且难以纯化。因此，本实验根据“一测多评”的思路[2]，拟用大黄素对照品为内标物，通过测定它与芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的校正因子，对大黄药材中5种成分的含量进行测定，为大黄药材的质量控制建立一种新的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪（色谱仪1）；岛津2010AHT高效液相色谱仪（色谱仪2）；Waters高效液相色谱仪（色谱仪3）；色谱柱：岛津C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；汉邦C18柱(4.6mm×250mm，5μm）；特纳C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；ABS265-S十万分之一天平。

1.2 试药 对照品：大黄素，批号：1 1 0 7 5 6-2 0 0 1 1 0 ，大黄酸，批号：110757-200206，大黄酚，批号：110796-200716，芦荟大黄素，批号：110795-200605，大黄素甲醚，批号：110758-200408，均购自中国食品药品检定研究院。大黄药材为药店采购。甲醇、磷酸为色谱纯，三氯甲烷、盐酸为分析纯，水为纯化水。

2 原理

在一定的线性范围内，紫外检测器的响应值（A）与组分的浓度（C）成正比，即：K=A/C[2][3][4]，在对多组分的物质进行含量测定时，可以先选定一个合适的组分作为内标物，建立该组分与其它组分的校正因子（ƒ），如公式（1）所示：

在一定的色谱条件下，配置一定浓度的内标物和对照品的溶液，以进样量为横坐标，以峰面积A为纵坐标，分别测定内标物和对照品的标准曲线，将标准曲线的截距校正为0后，用两条标准曲线斜率K的比值即可求得校正因子（ƒ） 。

以上公式即为用内标物与校正因子测定其它组分含量的计算公式。式中，SA为内标物质的峰面积或峰高；RA为对照品的峰面积或峰高；XA为供试品的峰面积或峰高；Sc为内标物质的浓度；Rc为对照品的浓度；Xc为供试品的浓度。

3 方法与结果

3.1 色谱条件[1]色谱柱： C 1 8 柱（4.6mm×250mm，5 μ m）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；检测波长：254nm；流速：0.8 ml·min-1；柱温：35℃；进样量10μl；理论板数按大黄素峰计不低于3000，各峰的分离度均应大于1.5。见附图。

3.2 对照品溶液的配制 精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚对照品各16mg，置200ml量瓶中（A瓶），精密称取大黄素甲醚对照品10mg置250ml量瓶中（B瓶），分别加甲醇至刻度；精密量取A瓶与B瓶中溶液各2ml置10ml量瓶中（C瓶），加甲醇至刻度，即得（每1ml中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各16μg，含大黄素甲醚8μg）。

3.3 供试品溶液的制备 取大黄粉末（过四号筛）0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10ml，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10ml加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4 线性范围：精密量取混合对照品溶液1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl，按“3.1”项下的色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品的进样量为横坐标，得各成分的标准曲线为：芦荟大黄素：Y=5857835X-16964，R=1.0000；大黄酸：Y=5402446X-22526，R=1.0000；大黄素：Y=5134066X-13903，R=1.0000；大黄酚：Y=5855968X+8868，R=0.9999；大黄素甲醚：Y=3794269X-8019，R=1.0000。各成分的线性关系良好。

3.5 校正因子（ƒ）的测定：精密量取混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl注入液相色谱仪，测定它们的峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品的进样量为横坐标绘制标准曲线，将标准曲线的截距校正为0后，内标物与对照品的斜率之比即为它们的校正因子（ƒ），见附表1。

3.6f值的耐用性考察：在用高效液相色谱法进行操作的时候，色谱条件通常会发生一些变化，因此，我们对几种常见的变化因素，包括色谱柱、色谱仪、波长偏差以及流速变化进行了考察，结果显示， 值的差异不大。见附表2。

3.7 各组分色谱峰的定位 在只使用一个对照品的情况下，如何对其他3个组分的色谱峰进行定位是一个关键问题，参照王智明[2]的思路，采用相对保留时间差对它们进行定性时，发现不同仪器对各组分的出峰时间影响较小，而不同填料色谱柱则对各组分的出峰时间影响较大，见附表3。由于同样的成分，在不同色谱柱及色谱仪器中光谱是相同或相似的，因此，为了对各组分色谱峰的定位更准确，可以采用相对保留时间差与光谱图相结合的方法确定色谱峰的归属。

3.8 一测多评法与外标法检测样品含量结果比较 取同一批大黄药材，分别采用对照品外标法和一测多评法测定6次，结果见附表4。每组数据经 检验，P值均＞0.05，两种方法结果无显著差异。

4 讨论

4.1 本文根据“一测多评”的思路，以大黄素为内标物，测定大黄素与其它组分的校正因子，用内标物加校正因子对其它组分的含量进行测定，结果显示，该法与对照品外标法测定结果没有显著差异，各校正因子在耐用性考察中重现性较好，说明“一测多评”应用到大黄的含量测定中是可行的。4.2 在使用“一测多评”进行样品含量测定的过程中，增加了校正因子这个量值，它的测量误差将直接传递给最终的测定结果，导致误差增大。为了合理表征测定结果的分散性，笔者认为今后可以对校正因子的不确定度进行评定。

4.3 同对照品外标法相比，使用“一测多评”具有以下优势：不仅可以减少对照品的使用量，还能简化样品的检验程序，对于一些价格昂贵，不易得到的对照品来说，非常适用，因此，在将来的药品检测方法的应用中，“一测多评”技术将具有很大的发展前景。