糖基化对β-乳球蛋白结构的影响

李晓明，孔阳辉，吕丽爽*

（南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097）

糖基化对β-乳球蛋白结构的影响

李晓明，孔阳辉，吕丽爽*

（南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097）

目的：考察还原糖以及活性二羰基化合物诱导的β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-lg）发生糖基化后结构的变化。方法：运用气相色谱法检测β-乳球蛋白+乳糖糖基化反应体系中二羰基化合物的产生，并通过紫外-可见分光光度法、圆二色谱法、体积排阻色谱法定性分析不同活性羰基引发糖基化反应对β-lg结构的改变。结果：β-乳球蛋白+乳糖糖基化反应体系可以迅速产生二羰基化合物，在125 ℃条件下，30 min后，丙酮醛和乙二醛含量高达207 μg/g和180 μg/g，而后逐渐减少并趋于稳定（150 μg/g）。光谱学实验结果表明，还原糖以及活性二羰基化合物可以有效地诱导β-lg结构从β-折叠转变为α-螺旋；通过体积排阻色谱实验，β-lg加热糖基化后在120～190 min有新的产物色谱峰产生。结论：还原糖和活性二羰基化合物能有效地诱导β-lg糖基化反应，引起其蛋白二级结构的改变。

β-乳球蛋白；圆二色谱；二羰基化合物；结构

蛋白质糖基化是蛋白质在糖以及活性二羰基化合物的作用下，蛋白质中的氨基酸残基的游离氨基与活性羰基作用引起的蛋白质结构及生物学功能改变的反应［1］。其中活性二羰基化合物（丙酮醛（methylglyoxal，MGO）和乙二醛（glyoxal，GO））是形成晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）的前体物质，具有高反应活 性，比葡萄糖的活性高200～50 000 倍［2］。蛋白质糖基化反应会形成分子内或者分子间交联，最终产生不同结构的AGEs［3］。

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-lg）是反刍动物乳中的主要乳清蛋白成分，天然β-lg以二聚体形式存在［4］。β-lg常作为辅助性配料用于乳制品、焙烤食品以及运动饮料等食品中。在食品的加工及贮藏过程中，β-lg易与还原糖发生非酶糖基化反应。糖基化虽然能改善乳球蛋白的乳化性、抗氧化性［5］以及降低致敏性［6-7］，但是，在β-lg糖基化的过程中会产生一系列对人体有害的AGEs［8］。与此同时，蛋白质糖基化还能引起β-lg分子结构的改变［9］。Fenaille等［9］利用电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）和基质辅助激光解吸附电离质谱（matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS）确定了β-lg与乳糖（lactose，Lac）或半乳糖的糖基化位点。糖基化可能会导致二级结构的变化，通过圆二色谱［10］技术可以考察α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲的增减。Chevalier等［11］对β-lg与不同还原糖在60 ℃条件下反应72 h后进行圆二色谱扫描，发现其在近紫外和远紫外区都有明显变化。蛋白质糖基化会引起蛋白质的交联，从而使其分子质量增大。目前，常用的检测蛋白质糖基化分子质量变化的手段有凝胶排阻色谱和聚丙烯酰胺凝胶变性电泳分析［12-13］。Chevalier等［11］发现β-lg与多种糖类糖基化反应后蛋白分子质量增加，小部分糖基化β-lg因发生交联，分子质量增大而保留在浓缩胶中，并且糖基化蛋白分子质量呈现高度的异质性。Gu Fenglin等［14］使用凝胶Sephadex G-75分离酪蛋白-葡萄糖糖基化产物，在220、280、420 nm波长处都监测到了2 个吸收峰。目前，其他研究学者也通过凝胶排阻色谱法分析检测乳球蛋白质糖基化后产物的变化情况［15-18］，结果表明，在280 nm波长处均有新的吸收峰产生。

还原糖中碳原子的数目也会影响蛋白质糖基化的程度和速度。Chevalier等［11］证实β-lg与核糖（ribose，Rib）反应糖基化程度最大，达到69.4%，而其他糖类与β-lg糖基化程度由大到小依次是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、乳糖。Jing Hao等［19］发现五碳糖比六碳糖更易和蛋白质产生AGEs，且单糖比双糖也更易反应。本实验通过建立乳球蛋白-还原糖体系以及乳球蛋白-二羰基化合物体系，对比考察还原糖以及糖基化反应中间产物二羰基化合物对β-lg结构的改变。首先运用气相色谱检测β-乳球蛋白+乳糖（β-lg+Lac）糖基化反应体系中二羰基化合物的产生，并通过紫外-可见分光光度法、圆二色谱法、体积排阻色谱法定性分析糖基化对β-lg结构的改变，进而为其功能的研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

β-lg（纯度≥92%，蛋白质分子质量18.4 kD） 南京师范大学随园校区金陵女子学院605实验室自制；2，3-丁二酮 上海国药集团化学试剂有限公司；二氯甲烷 南京化学试剂有限公司；衍生化试剂邻苯二胺、MGO（40%质量分数水溶液）、GO（40%质量分数水溶液）美国Sigma-Aldrich公司；丙烯酰胺、N-N'-甲叉双丙烯酰胺、N，N，N，N-四甲基乙二胺、过硫酸铵、三羟基氨基甲烷、溴酚蓝、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、核糖、乳糖生工生物工程（上海）股份有限公司；β-巯基乙醇、冰醋酸 南京赛吉科技有限公司。

1.2仪器与设备

7820气相色谱仪 美国安捷伦科技公司；KQ-300B超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HGC-12A氮气吹干仪 天津恒奥科技发展有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；HH-6数显恒温水浴锅金坛市富华仪器有限公司；FA2104N电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司；DYCZ-24D型夹芯式垂直电泳槽、JY600C型稳压稳流定时电泳仪 北京市六一仪器厂；UV-61000紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；Chirascan圆二色光谱仪 英国应用光物理公司。

1.3方法

1.3.1气相色谱法测定β-lg糖基化中间产物MGO和GO

1.3.1.1β-l g+Lac模拟体系的制备

用0.05 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）溶解β-lg，在10 mL的离心管中加入3.5 mg/mL β-lg稀释液3 mL，再加入0.05 mmol/L pH 7.4的PBS稀释后的乳糖溶液（49.7 mg/mL）4 mL，使其与乳球蛋白的浓度比为1 000∶1，体系最终体积为7 mL。置于高压灭菌锅中，在125 ℃条件下反应0、15、30、45、60 min后，迅速置于冰浴中冷却，14 000×g离心5 min，取上清液为待测试样。空白组以PBS代替乳糖溶液，做3 组平行实验。

1.3.1.2样品中二羰基化合物的衍生化

依据文献［20］的测定方法，并加以改进，即在10 mL样品管中分别加入上一步生成的β-lg糖基化待测试样2 mL，各加1 mL 100 mmol/L的邻苯二胺，0.5 mL 1 mmol/L的2，3-丁二酮（内标）配制液，混匀，60 ℃水浴加热15 min，冰浴冷却5 min后在室温条件下加1 mL 2 mol/L的乙醛，混 匀，60 ℃水浴加热15 min，冰浴5 min后在室温条件下加2 mL二氯甲烷，超声波萃取15 min，重复萃取3 次。下层二氯甲烷相氮气吹干，用0.5 mL二氯甲烷复溶，取1 μL进行气相色谱检测。

1.3.1.3气相色谱检测条件

依据文献［20］的测定方法，并加以改进。色谱柱：HP-5色谱柱（30 m× 0.32 mm，0.25 μm）；进样温度：250 ℃；压力：10 p si；分流比：1∶1；色谱柱升温方式：初始值40 ℃，保持1 min，以4 ℃/min程序升温，升至140 ℃，保持1 min；以50 ℃/min升至250 ℃，保持1 min，总运行时间30.2 min；氢火焰离子检测器温度：280 ℃；H2流量：30 mL/mi n；空气流量：300 mL/min；N2流量：25 mL/min；上样量：1 μL。

2 mL不同浓度的MGO和GO标准品取代待测试样如上述条件进行衍生化，气相色谱测定其含量，制作标准曲线。

1.3.1.4二羰基化合物含量的计算

以丁二酮为内标物，二羰基化合物喹喔啉衍生物主要的摩尔吸光系数来源于喹喔啉端，计算二羰基化合物喹喔啉衍生物峰面积与内标物峰面积之比，并以峰面积之比（y）对二羰基化合物含量（x）进行线性回归。

1.3.2β-lg糖基化反应对体系pH值的影响

将适量β-lg溶于蒸馏水中，在10 mL具塞试管中分别加入乳糖、核糖、MGO、GO，使得β-lg最终质量浓度为1.5 mg/mL，β-lg与糖的物质的量比为1∶1 000，MGO、GO的最终浓度为1.5 mmol/L。参考文献［21］的方法，用1 mol/L的NaOH将体系初始pH值调为8.5，95 ℃水浴加热。在反应0、0.5、1、2、3、4 h后分别取样，置于冰水中冷却，然后在室温测量体系的pH值。空白组只加入β-lg，每个反应做3 组平行。

1.3.3糖基化对β-lg结构的影响

1.3.3.1β-lg+Lac模拟体系的制备

用浓度为0.05 mmol/L，pH 7.4的PBS溶解β-lg，在10 mL具塞试管中分别加入乳糖、核糖、MGO、GO，使得β-lg最终质量浓度为1.5 mg/mL，β-lg与糖的物质的量之比为1∶1 000，MGO、GO的最终浓度为1.5 mmol/L。60 ℃水浴加热，在反应0、4、8、16、24、48 h处各取1 mL，置于冰水中冷却至室温。

1.3.3.2紫外光谱分析

取上述反应液，用蒸馏水稀释4 倍，利用紫外分光光度计在200～500 nm波长范围内测量其吸光度。空白组只加入β-lg，每组反应做3 个平行。

1.3.3.3圆二色谱分析

取上述反应液，用蒸馏水稀释3 倍。选用光径为1 mm的比色皿，用圆二色光谱仪分别在200～250 nm波段（远紫外区）和250～300 nm波段（近紫外区）进行扫描检测。

1.3.4凝胶色谱柱分析β-lg糖基化产物

用0.05 mmol/L pH 7.4的PBS溶解β-lg，在10 mL的离心管中加入3.5 mg/mL β-lg稀释液3 mL，再加入PBS稀释后的乳糖溶液4 mL，使其与β-lg的浓度比为1 000∶1，体系最终体积为7 mL。反应试样95 ℃水浴加热，在0、30、60、120、180、240 min时分别取样1 mL，冰浴冷却，置于4 ℃保存。Sephadex G-75层析柱（1.0 cm×80 cm）装柱，0.8 mL/min蒸馏水平衡12 h。将0.1 mL待测试样加于层析柱界面，0.8 mL/min的蒸馏水进行洗脱，280 nm波长处检测吸收峰。

2　结果与分析

2.1β-lg糖基化中间产物MGO和GO的产生

依据1.3.1.4节中MGO和GO标准曲线的测定方法，可得标准曲线回归方程：MGO：y = 0.362 1x－0.441 5（R2= 0.996 1）；GO：y = 0.371x－0.427 2（R2=0.997 1）。其中，y为二羰基化合物喹喔啉衍生物与内标喹喔啉衍生物气相色谱峰面积之比，x为二羰基化合物含量。

图1　二羰基化合物的含量随时间的变化（125 ℃，pH 7.5）Fig.1 Effect of reaction time （at 125 ℃ and pH 7.5） on dicarbonyl compounds content

由图1可知，随着反应时间的延长，蛋白质糖基化反应程度加强，形成MGO和GO。在0～30 min内，MGO和GO形成的量随着反应时间的延长增加，增长趋势非常显著。30 min时，MGO和GO产生量均达到最高，分别为207 μg/g和180 μg/g。在30～60 min时，二羰基化合物产生的量开始下降，且维持在150 μg/g左右。MGO和GO两者相比，相同反应时间内MGO产生的量均高于GO。结果表明，β-lg糖基化过程中可以产生大量的二羰基化合物（MGO和GO），进一步证实了二羰基化合物作为糖基化反应中间产物，能有效的诱导β-lg糖基化，为后续研究还原糖以及二羰基化合物对β-lg糖基化作用效果提供了依据。

2.2β-lg糖基化反应对体系pH值的影响

图2　2β-lg糖基化反应对体系pHH值的影响Fig.2 Influnece of β-lg glycation reaction on pH

β-lg糖基化反应体系的pH值变化情况如图2所示。随反应时间延长，各体系的pH值均呈下降趋势。下降程度与空白组相比均具有显著差异（P＜0.05）。在0～60 min内，各体系pH值下降速率较快，120 min后，除β-lg+Rib体系pH值下降速率继续增加外，其余3 个体系的pH值下降趋于平衡，且相互之间没有明显差异。在240 min时，β-lg+Rib体系pH值由8.5降低到7.0。Jiang Zhanmei等［21］研究发现，糖基化中期形成的有机酸，如甲酸、乙酸是导致糖基化体系pH值的下降的原因。

2.3紫外光谱分析糖基化对β-lg结构的影响

图3　60 ℃反应体系紫外光谱随时间的变化（0、4、8、16、24、48 h）Fig.3 Ultraviolet spectra of glycated β-lg at different reaction times（0， 4， 8， 16， 24 and 48 h） at 60 ℃

如图3所示，60 ℃条件下反应48 h，各β-lg糖基化体系中β-lg在250～400 nm波长范围内的吸光度随着反应进程推进而不断增加，且各个体系中不同反应时间下的吸光度均存在极显著差异（P＜0.000 1）。表明在各底物作用下，β-lg结构发生了变化。β-lg在280 nm波长处有特征吸收峰，这主要是由蛋白质中的酪氨酸的酚基和色氨酸的吲哚环共同作用所引起的［22］。因此糖基化反应后β-lg在280 nm 波长处的吸光度增加，推测为各底物与β-lg中的酪氨酸［23］和色氨酸［24］发生了反应。由图3b可知，β-lg+Rib体系吸光度增加程度最大，280 nm波长处反应4 h，体系的吸光度已是初始的2.33 倍，48 h后达到11.33 倍；由图3a、3c可知，β-lg+Lac和β-lg+MGO体系的吸光度虽增加程度小，但是变化也较为明显，β-lg+Lac体系在280 nm波长处反应8 h的吸光度是初始的1.26 倍，48 h达到1.66 倍；β-lg+GO的吸光度变化最小（图3d）。

2.4圆二色谱分析糖基化对β-lg结构的影响

图4　60 ℃β-lg+Lac体系的圆二色谱变化Fig.4 Circular dichroismin spectra of glycated β-lg at different reaction times at 60 ℃

60 ℃条件下，48 h内观测β-lg+Lac体系圆二色谱随反应时间的变化，结果如图4所示。200～250 nm远紫外区吸收信号来源于肽键，可表征蛋白的二级结构；250～300 nm近紫外区吸收则是由于芳香族氨基酸（如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸），反映氨基酸侧链及二硫键的特征。蛋白质二级结构特征不同，所产生的圆二色谱带位置、吸收强度也不相同，因此，根据所测得蛋白质的圆二色谱能反映出蛋白质二级结构的信息［5］。从图中可以看出，随着反应时间的变化，圆二色谱带呈规律性变化，说明随着反应进程的递进，糖基化逐渐改变β-lg的二级结构。β-lg+Lac反应体系在远紫外区的吸收强度明显高于β-lg，有非常明显的负峰，并且随着反应时间的延长负峰增大，表明糖基化反应不断改变着β-乳球蛋白的二级结构。

表1　不同反应底物对-lg二级结构的影响Table 1 Secondary structures of reaction products of β-lg with different substrates

60 ℃条件下，48 h后观测β-lg糖基化后二级结构的变化，结果如表1所示。3 个反应体系中的β-lg二级结构都有了明显变化：β-折叠结构降低，α-螺旋结构增加表明糖基化使得β-lg β-折叠结构转化为α-螺旋结构。另外，无规卷曲结构均有一定程度的降低。乳糖和二羰基化合物中，MGO诱导β-lg二级结构变化程度最为明显，α-螺旋结构增加9%，β-折叠结构减少6.5%。β-lg糖基化后糖基化后二级结构由β-折叠结构转化为α-螺旋结构，与Chevalier等［11］报道相符合。Chevalier等［11］对β-lg与不同还原糖60 ℃条件下反应72 h后进行圆二色谱扫描，发现结构由β-折叠结构转化为α-螺旋结构，这可能会引起蛋白质功能的改变。

2.5体积排阻色谱分析糖基化对β-lg的影响

采用体积排阻色谱监测280 nm波长处β-lg与乳糖糖基化反应前后的变化，结果如图5所示。β-lg纯品在48～72 min左右出峰，最大吸收峰值为0.14。β-lg与乳糖发生糖基化反应后，相同上样量的蛋白质吸光度增加，并与糖基化时间成正相关性，反应时间为30～240 min的糖基化反应体系在48～72 min左右最大吸光度分别为0.21、0.27、0.32、0.66、0.93，推测其为糖基化产物1。糖基化反应60 min后，洗脱时间120～190 min之间出现一个吸收峰，推测为糖基化产物2，具体是何种物质，还有待进一步的鉴定分析。

3　结 论

通过对β-lg+Lac体系的研究，表明在生理条件下，β-lg与乳糖发生非酶糖基化反应产生二羰基化合物，且产生MGO的能力较GO更强。MGO、GO含量在30 min时达到最高值，分别为207 μg/g和180 μg/g，而后平衡在150 μg/g左右。因此研究由活性二羰基化合物（MGO和GO）引起的蛋白质糖基化意义重大。

β-lg与不同底物糖基化反应时，体系的pH值会随着反应时间的延长而下降。核糖体系pH值下降最为明显，由初始8.5下降至7.0。引起β-lg糖基化过程中pH值下降程度：核糖＞MGO≈乳糖＞GO，GO引起蛋白质糖基化后pH值变化的能力与核糖和MGO相比并不显著，4 h后下降0.1。

通过对β-lg+Lac、β-lg+MGO以及β-lg+GO体系的紫外光谱和圆二色谱进行分析，结果表明在本实验模拟的生理条件下，β-lg糖基化后，280 nm波长处吸光度会随糖基化时间的延长而增加；二级结构发生变化，α-螺旋增加，β-折叠、无规卷曲减少。通过比较乳糖、MGO、GO可以发现，MGO对蛋白质糖基化的作用最强，引起二级结构发生变化的能力：MGO＞乳糖＞GO。反应48 h，MGO诱导β-lg二级结构变化程度最为明显，α-螺旋结构增加9%，β-折叠结构减少6.5%。

糖基化蛋白经Sephadex G-75体积排阻色谱检测，结果显示随糖基化反应时间的延长，48～72 min左右的峰值增加，120～190 min之间出现一个新的吸收峰，推测对应两个组分均为糖基化产物。

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Effect of Glycation on Structural Properties of β-Lactoglobulin

LI Xiaoming， KONG Yanghui， LÜ Lishuang*
（Ginling College， Nanjing Normal University， Nanjing 210097， China）

Purposes： To study the structural changes of β-lactoglobulin （β-lg） after glycation induced by reducing sugar or dicarbonyl compounds. Methods： The content of dicarbonyl compounds produced from β-lg and lactose was determined by gas chromatography. The structural changes of β-lg caused by glycation initiated by different active carbonyl groups were evaluated by ultraviolet （UV）-visible spectrophotometry， circular dichroism and size exclusion chromatography. Results：Dicarbonyl compounds were produced by β-lg glycation. The contents of methylglyoxal and glyoxalall reached the highest levels at 207 μg/g and 180 μg/g respectively after heating for 30 minutes. Then， the quantity of dicarbonyl compounds began to decline， and remained at approximately 150 μg/g. The UV-visible and circular dichroism spectra showed effective transformation of β-sheet to α-helix induced by glycation. By Sephadex G-75 sizeexclusion chromatography， a new absorption peak was detected between 120 and 190 min， indicati ng the occurrence of β-lg glycation. Conclusion： Reducing sugar and dicarbonyl compounds have a very strong role in β-lg glycation reaction and consequently may change the structure of β-lg significantly.

β-lactoglobulin； circular dichroism； dicarbonyl compounds； structure

TS201.2

A

1002-6630（2015）15-0075-06

10.7506/spkx1002-6630-201515015

2014-09-22

2012年度江苏省基础研究计划（自然科学基金）项目（BK2012850）

李晓明（1989—），男，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail：lixiaoming2000@163.com

吕丽爽（1969—），女，副教授，博士，研究方向为功能性食品的分离及活性。E-mail：lishuanglv@yahoo.com.cn