实时超声造影技术分析兔VX2肝癌模型的实验研究

朱培华　黄敬垣★　叶萌　杨继东　洪勇强

实时超声造影技术分析兔VX2肝癌模型的实验研究

朱培华黄敬垣★叶萌杨继东洪勇强

目的 探讨应用实时超声造影（CEUS）技术检查兔 VX2肝癌模型的临床价值。方法 选取30只新西兰大白兔制成VX2肝癌模型，分别行常规超声检查及经兔耳缘静脉注射超声造影剂行CEUS检查，观察肝癌模型的影像学特点，获得并分析肝癌模型中肿瘤组织的CEUS定量参数的特点，并与肝癌模型的病理切片比较分析。结果 兔VX2肝癌结节进行CEUS检查时均表现为典型的“快进快退”增强特点。兔VX2肝癌组织的AS、PI、AUC较周围邻近正常肝组织明显增高（P＜0.05）；AT、TTP较周围邻近正常肝组织明显减少（P＜0.05）。CEUS检查对兔VX2肝癌结节的总体检出率及对微小肝癌、小肝癌的敏感度和准确度均高于常规超声检查（P＜0.05）。CEUS对直径0.3～0.5cm微小肝癌的检出率（85.71%）高于常规超声（P＜0.05）。与直径＞1.0cm小肝癌比较，直径＜1.0cm微小肝癌的CEUS定量参数AT、TTP明显增加（P＜0.05）。结论 CEUS不仅能提供肝癌病灶的微小血管形态结构信息，而且能实时反映其血流灌注情况，有助于小肝癌及微小肝癌的检出及定性诊断。

兔 VX2肝癌模型 原发性肝细胞癌 实时超声造影技术

原发性肝细胞癌（HCC）在我国较为常见，因其恶性程度高，且对放疗化疗均不敏感，预后差。临床对小肝癌、微小肝癌常难以早期发现。作者应用实时超声造影 （CEUS）技术对兔VX2肝癌模型进行观察，探讨HCC 的CEUS实时动态增强效应特征及其定量参数特点，旨在提高HCC诊断率及检出率。

1　材料与方法

1.1实验动物模型 30只健康纯种新西兰大白兔由浙江大学动物实验中心提供，雌雄不作限制，所有实验兔均为CL级，体质量2.0～3.0kg。

1.2常规超声检查及CEUS检查 实验兔VX2成瘤组织种植完毕于21d后，由中级职称以上且经验丰富的超声诊断医师对其进行常规超声检查及CEUS检查。使用Philips iU22超声诊断仪（L9-3宽频线阵探头，频率为10MHZ，机械指数设定为0.07）。采取仰卧位将实验兔固定于实验操作台上。首先采用常规二维超声多方位多切面观察兔VX2肝癌模型，观察内容主要包括：肿瘤病灶的部位、大小、形态、内部回声、边界、数量。启动彩色多普勒观察肝癌肿瘤病灶的血供情况。将意大利博莱科公司提供的Sonovue加入0.9%的氯化钠5ml稀释备用。以24G的静脉留置针于实验兔的耳缘静脉建立静脉通道。进行实时超声造影时，采用1ml注射器按照0.1ml/kg的剂量经静脉通道进行团注，随后以2ml生理盐水进行超声造影剂团注后的冲管。团注造影剂的同时，立刻启动实时动态超声造影计时器，并对造影影像资料作记录（记录时长约3min），保存至超声诊断仪的主机内置硬盘中，作后续分析观察。对超声造影进行时间-强度分析时，使用QLAB软件完成，并获取感兴趣区域（肿瘤组织以及其周边邻近正常肝组织）的CEUS分析参数：曲线下面积（AUC）、峰值强度（PI）、开始增强时间（AT）、曲线增强上升斜率（AS）、达峰时间（TTP）［1］。CEUS时相判断：动脉相-CEUS开始后10s～30s；门脉相-CEUS开始后30～120s；延迟相-CEUS开始后120～360s。CEUS肿瘤组织“增强程度”判断标准：以肿瘤病灶周边邻近正常的肝组织回声作参照进行比较，呈现四个级别（“高增强”、“等增强”、“低增强”、“无增强”）。

1.3病理学检查 动物实验结束后，采用空气栓塞法将实验兔全部处死，切除实验兔的肝脏，观察兔VX2肝癌模型肿瘤标本的情况，记录实验兔肝癌结节的数目并精确测量每个结节的大小。将标本浸入浓度为10%的甲醛液内行标本固定，常规石蜡包埋后进行连续切片（厚度为3.0μm），常规HE染色后并以中性树胶进行封片，将制作好的组织标本进行病理分析观察。

1.4统计学处理 采用 SPSS 16.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，用t检验；计数资料以%表示，用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1兔VX2肝癌模型的CEUS检查 超声造影剂经实验兔耳缘静脉通道注入后约5s左右即开始出现动脉相增强，病灶结节周边可见渐进性的“环状”增强或“树枝状”增强。门脉相超声造影剂即开始出现廓清，因该时相正常肝组织的造影回声不断增强，而病灶结节的增强即不断减弱，两者比较，病灶结节呈低回声。整个CEUS过程表现为恶性肿瘤的典型增强方式：“快进快退”型。如病灶中央出现坏死区时仅见病灶周边的“环状”增强。

2.2肝癌病灶组织与周围邻近正常肝组织的CEUS定量参数比较 见表1。

表1　肝癌组织与正常肝组织CEUS定量参数比较 （x±s）

2.3常规超声检查和CEUS检查对兔VX2肝癌结节的检出情况比较 病理检查发现兔VX2肝癌结节63个，其中37个为1.1～3.0cm的小肝癌，11个为0.3～1.0cm的微小肝癌。（1）常规超声检查：发现肝癌结节47个（结节直径范围0.5cm～4.3cm），其中包括微小肝癌7个（4个病理解剖证实，结节直径＞1cm）、小肝癌28个（3个病理解剖证实，结节直径＞3cm）。常规超声检查对肝癌结节总体检出率74.60%。小肝癌敏感度67.57%、特异度88.46%、准确度76.19%，阳性预测值89.29%、阴性预测值65.71%。微小肝癌敏感度27.27%、特异度92.31%、准确度80.95%，阳性预测值42.86%、阴性预测值85.71%。（2）CEUS检查：发现肝癌结节59个（结节直径范围0.4～4.1cm），其中包括微小肝癌10个（1个病理解剖证实，结节直径＞1cm）、小肝癌35个（1个病理解剖证实，结节直径＞3cm）。CEUS检查对肝癌结节总体检出率93.65%；小肝癌敏感度91.89%、特异度96.15%、准确度93.65%、阳性预测值97.14%、阴性预测值89.29%；微小肝癌敏感度81.82%，特异度98.08%、准确度95.24%，阳性预测值90.00%、阴性预测值96.23%。（3）CEUS检查与常规超声检查比较：CEUS检查对兔VX2肝癌结节总体检出率（χ2值=8.558、P值=0.003）、微小肝癌的敏感度（χ2值=6.600、P=0.010）、准确度（χ2=6.130，P值=0.013）及小肝癌的敏感度（χ2=6.773，P=0.009）、准确度（χ2=7.499，P=0.006）均高于后者，差异有统计学意义（P＜0.05）；两种检查方法对兔VX2微小肝癌特异度（χ2=1.891，P=0.169）、小肝癌的特异度（χ2=1.083，P=0.298），差异均无明显统计学意义（P＞0.05）。

2.4CEUS对微小肝癌的检出情况 CEUS对微小肝癌的总检出率（81.82%）明显高于常规超声（27.27%），差异有统计学意义（χ2=6.600、P=0.010）。CEUS对直径0.3～0.5cm微小肝癌的检出率（85.71%）明显高于常规超声（14.29%），差异有统计学意义（χ2=7.143、P=0.008）。CEUS对直径0.5～1.0cm微小肝癌的检出率（75%）高于常规超声（50%），但差异无统计学意义（χ2=0.533、P=0.465）。

2.5直径＜1.0cm微小肝癌CEUS参数特征 见表2。

表2　微小肝癌与小肝癌的CEUS参数比较（x±s）

3　讨论

临床上将肿瘤病灶直径为1～3cm的肝癌称为小肝癌，而直径＜1cm的肝癌称为微小肝癌，其早期可无明显的临床症状。如何提高小肝癌、微小肝癌的检出率及诊断准确率成为目前肝癌医学影像学研究的热点。

肝癌的发生发展过程中，肝癌的新生血管最先生成，包绕肝癌病灶边缘后通过分支伸入肝癌病灶内部滋养肝癌实质，最终形成血供丰富的新生血管网，在这网架结构基础上继而出现肝癌细胞增生。本资料中，所有兔VX2肝癌模型的肿瘤病灶在进行CEUS检查时均可探及较丰富的动脉血供，并表现出“快进快退”的造影特征，即动脉期肿瘤病灶出现快速增强，门脉期即表现为快速廓清［2］。这是CEUS对肿瘤良恶性作出鉴别诊断的基础。这与肿瘤病灶的血供以肝动脉供血占绝对优势有关。肝癌组织的供血动脉异常增生、移位、变形、包绕、扩张及动静脉瘘形成，可使超声造影剂快速到达肿瘤病灶的内部组织，一般为造影开始后的5～10s［3］，以致于动脉相早期CEUS即可显示肿瘤病灶的灌注情况及滋养血供情况。因此利用CEUS能更加敏感地显示小肝癌、微小肝癌结节。有利于小肝癌、微小肝癌的早期检出，为肝癌患者的临床治疗提供早期客观的医学影像学依据。

正常肝脏供血来自于肝动脉以及门静脉的双重供血，而肝癌结节的供血即主要来自于肝动脉供血，两者供血方式存在着差异。本资料中，肿瘤病灶组织的CEUS定量参数中AS、 PI、AUC较其周边邻近正常肝组织明显增大（P＜0.05），提示兔VX2肝癌模型中肿瘤病灶组织内部具有异常丰富的新生微小动脉，必然导致肝癌病灶组织内血供随之增加，提示HCC恶性的倾向［4］，有助于CEUS对肿瘤病灶结节的性质判定，即有助于小肝癌、微小肝癌的定性诊断。本资料中，与周边邻近正常肝组织比较，肿瘤病灶组织的CEUS定量参数中AT 、TTP明显减少（P＜0.05），表明肿瘤病灶组织出现提前灌注。原因可能是一方面肿瘤病灶组织内新生微小动脉血管的异常增生，使肝动脉的优势供血构成比例远超门静脉［5］，并占绝对性的主导地位，进入病灶结节组织的血流量较正常肝组织明显增多。另一方面肿瘤病灶组织内新生血管具有极高的通透性，进一步提高超声造影剂的灌注速度，缩短灌注时间［6］。CEUS检查对肝癌病灶结节的检出能力明显优于常规超声检查，尤其对临床上难以发现的直径＜1.0cm的微小肝癌的诊断能力更突出，其临床诊断的漏诊率更低。且本资料中，CEUS对兔VX2肝癌结节的检查较常规超声检查具有更高的准确度（P＜0.05），且对小肝癌的准确度达93.65%，对微小肝癌的准确度达95.24%，其值均＞0.75，表明CEUS检查对肝癌病灶结节的诊断具有更高的临床应用价值，尤其对小肝癌和微小肝癌的诊断检查，CEUS明显优于常规超声检查。

本资料中，与直径＞1.0cm小肝癌比较，直径＜1.0cm微小肝癌的CEUS定量参数AT及TTP明显增加（P＜0.05），提示微小肝癌组织的超声造影剂灌注迟于小肝癌。原因可能与微小肝癌直径体积小，分化程度更高，癌结节内肿瘤细胞组织及血管结构分布更接近正常，异常增生小动脉相对较少，肝动脉供血相对较少，而门静脉供血相对较多，致使AT、TTP增加，而随着肿瘤体积增大及分化程度降低，肿瘤内血管结构分布越偏离正常，肝动脉供血越占优势，血流灌注量不断增加，造影剂灌注加快，即AT、TTP减小，且随着肿瘤不断生长增大，动静脉瘘形成数量随之增加，灌注进一步提前［7］。这同时提示不同大小的肝癌结节CEUS定量参数的变化特征与其分化程度以及恶性程度密切相关，有助于肿瘤性质的初步判断，有利于肝癌的分期。

1Yoon CJ，Chung JW， Park JH，et al . Transcatheter arterial embolization with 188Rhenium-HDD-labeled iodized oil in rabbit VX2 liver tumor.J Vasc Interv Radiol，2004，15（10）：1121～1128.

2陈敏华，严昆.新型造影剂与灰阶超声造影技术对肝肿瘤的诊断价值，中华超声影像学杂志，2004，13（1）：38～42.

3Numata K，Luo W，Morimoto M，et al. Contrast enhanced ultrasound of hepatocellular carcinoma .World J Radiol，2010，2（2）：68～82.

4齐铮琴，赵玉珍，杨漪，等 .卵巢肿瘤经阴道彩色多普勒超声与微血管密度的对比研究，中国医学影像技术，2006，22（4）：603～605.

5周军华，赵玉珍，董超，等.原发性肝癌超声造影定量血流灌注参数与病理微血管密度对比分析.中国超声医学杂志，2008，24（1）：47～49.

6丁雪明，李智贤，韦康来，等.肝细胞癌的超声造影定量灌注参数与MVD、VEGF表达的关系.中国超声医学杂志，2009，25（11）：1054～1057.

7Liu GJ，Xu HX，Lu MD，et al. Correlation between enhancement pattern of hepatocellular carcinoma on real-time contrast enhanced ultrasound and tumour cellular differentiation on histopathology .Br J Radiol，2007，80（953）：321～330.

Objective To explore the clinical application value of that to check rabbit VX2 liver cancer model using contrast enhanced ultrasound （CEUS）. Methods 30 New Zealand white rabbits were made into VX2 liver cancer model .Respectively performed the conventional ultrasound check and CEUS check .Observed the imaging characteristics of liver cancer model .Obtained and analyzed the CEUS quantitative parameters of tumor tissue in the liver cancer model. And compared with the pathological slice of the liver cancer model . Results Rabbit VX2 liver cancer nodules show the typical enhanced features ："fast forward fast rewind" by CEUS. Compared with neighbour normal liver tissue，the AS，PI，AUC of rabbit VX2 liver cancer tissue were increased obviously （P＜0.05）；the AT、TTP were decreased signifi cantly （P＜0.05）.Compared with conventional ultrasound check，the overall detection rate of rabbit VX2 liver cancer nodules，as well as the sensitivity and accuracy of micro hepato cellular carcinoma（MHCC）、small hepato cellular carcinoma（SHCC） were higher using CEUS check （P＜0.05）. The detection rate of CEUS （85.71%）was higher than conventional ultrasound in MHCC with 0.3 ～ 0.5cm diameter（P＜0.05）.Compared with SHCC with diameter＞1.0 cm，the quantitative parameters of CEUS ：AT、TTP signifi cantly increased （P＜0.05） in MHCC with diameter＜1.0 cm. Conclusions CEUS can provide the information of tiny blood vessels structure in liver cancer，can refl ect the blood perfusion，help detect and diagnose to MHCC、SHCC.

Rabbit VX2 liver cancer model Hepatic cell carcinoma Contrast enhanced ultrasound

浙江省医药卫生科技计划一般研究计划项目（2013KYB015）

310013 浙江医院超声科