5种蛋白酶对猪皮胶原蛋白水解效果的比较研究

肖岚，李诚，付刚，余霞，杜昕，李曦染

（1.四川农业大学食品学院，四川雅安625014；2.四川旅游学院食品科学系，四川成都610100）

5种蛋白酶对猪皮胶原蛋白水解效果的比较研究

肖岚1，2，李诚1，*，付刚1，余霞1，杜昕1，李曦染1

（1.四川农业大学食品学院，四川雅安625014；2.四川旅游学院食品科学系，四川成都610100）

以新鲜猪皮为原料，分别采用中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶5种不同蛋白酶水解胶原蛋白，以水解度（DH）和超氧阴离子自由基（O2－·）清除率为指标，根据单因素和正交试验优化5种蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的最适条件；比较分析5种蛋白酶对猪皮胶原蛋白的水解效果。结果表明：5种蛋白酶对猪皮胶原蛋白的水解产物均具有抗氧化性，其水解产物对O2－·清除率依次为：胰蛋白酶水解产物＞中性蛋白酶水解产物＞胃蛋白酶水解产物＞菠萝蛋白酶水解产物＞木瓜蛋白酶水解产物。

中性蛋白酶；菠萝蛋白酶；胃蛋白酶；木瓜蛋白酶；胰蛋白酶；水解度；O2－·清除率

猪皮资源价廉易得，猪皮中胶原蛋白含量丰富，但其特殊异味、不良口感、消化率低、加工不便等不利因素严重制约了猪皮资源在生物医用领域、食品领域中的开发利用［1］。胶原蛋白水解产物中存在具有生理活性的肽，其作用包括抗氧化［2-3］、降血压［4-5］、提高骨密度［6-7］、抑制血小板凝集［2］、降低胆固醇［2］等。目前胶原蛋白活性肽主要是通过体外消化胶原蛋白或明胶来获得，包括高压降解，酸、碱降解和酶法降解等；其中酶法制备胶原肽优点最多，如安全性高、生产条件温和，且选择不同的蛋白酶、控制反应条件就可以得到特定的活性肽，这为进一步开发高附加值的产品奠定了良好的基础［8］。但是，长期以来，国内［9-11］对制备胶原蛋白活性肽的蛋白酶的研究一直不够深入，相关的研究工作也远远落后于国外［4-5，12］。

因此，本试验以猪皮为原料提取胶原蛋白，分别采用中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶对胶原蛋白水解制备抗氧化肽，以水解度（DH）和超氧阴离子自由基（O2－·）清除率为指标，根据单因素和正交试验优化水解条件，比较分析5种不同蛋白酶在最适水解条件下对猪皮胶原蛋白的水解效果，为其应用于抗氧化肽的制备提供理论参考和试验参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜猪皮，购于雅安市农贸市场；中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶：广西南宁庞博生物工程有限公司；其他试剂均符合国家有关标准。

1.2仪器与设备

UV-3200紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；RE-5203旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；BR4i型多功能冷冻离心机：法国THERMO JOUAN公司。

1.3方法

1.3.1猪皮胶原蛋白的制备

根据前期试验确定的最佳工艺流程制备猪皮胶原蛋白［13-15］。

工艺流程：预处理→脱脂→水解→调节pH→过滤→浓缩→猪皮胶原蛋白

1.3.2猪皮胶原蛋白的水解

称取一定量的胶原蛋白溶于蒸馏水中，按照试验设计配制成相应质量浓度的胶原蛋白样液作为水解底物，分别研究5种蛋白酶对底物的水解效果。选取酶与底物比、pH、水解温度、底物质量浓度、水解时间5个因素为自变量，以DH和O2－·清除率为应变量，做单因素试验。根据单因素试验结果进行猪皮胶原蛋白水解正交试验，以确定5种蛋白酶水解胶原蛋白的最适条件。

1.3.2.1菠萝蛋白酶水解条件的研究

确定底物浓度为6%，选择水解温度（℃）、pH、水解时间（h）、酶与底物比（U/g）作为试验因子，以DH和O2－·清除率为指标，采用L9（34）正交试验设计，确定菠萝蛋白酶水解胶原蛋白的最适条件。正交试验表如表1。

表1　菠萝蛋白酶正交试验因素水平表Table 1The factors of the orthogonal test of Bromelain

1.3.2.2木瓜蛋白酶水解条件的研究

确定底物浓度为6%，选择水解温度（℃）、pH、水解时间（h）、酶与底物比（U/g）作为试验因子，以DH和O2－·清除率为指标，采用L9（34）正交试验设计，确定木瓜蛋白酶水解胶原蛋白的最适条件。正交试验表如表2。

表2　木瓜蛋白酶正交试验因素水平表Table 2The factors of the orthogonal test of Papain

1.3.2.3中性蛋白酶水解条件的研究

确定底物浓度为6%，选择水解温度（℃）、酶与底物比（U/g）、pH、水解时间（h）作为试验因子，以DH和O2－·清除率为指标，采用L9（34）正交试验设计，确定中性蛋白酶水解胶原蛋白的最适条件。正交试验表如表3。

表3　中性蛋白酶正交试验因素水平表Table 3The factors of the orthogonal test of Neutral Protease

1.3.2.4胰蛋白酶水解条件的研究

确定底物浓度为10%，选择pH、水解时间（h）、酶与底物比（U/g）、水解温度（℃）作为试验因子，以DH和O2－·清除率为指标，采用L9（34）正交试验设计，确定胰蛋白酶水解胶原蛋白的最适条件。正交试验表如表4。

表4　胰蛋白酶正交试验因素水平表Table 4The factors of the orthogonal test of Trypsin

1.3.2.5胃蛋白酶水解条件的研究

确定底物浓度为8%，选择水解温度（℃）、酶与底物比（U/g）、pH、水解时间（h）作为试验因子，以DH和O2－·清除率为指标，采用L9（34）正交试验设计，确定胃蛋白酶水解胶原蛋白的最适条件。正交试验表如表5。

表5　胃蛋白酶正交试验因素水平表Table 5The factors of the orthogonal test of Pepsin

1.3.3指标测定

1.3.3.1DH的测定

采用甲醛滴定法［16-17］。

1.3.3.2O2-·清除率测定

取0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）4.5 mL，置于25℃水浴中预热20min，分别加入1mL样品和0.4mL 25 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5 min，加入8 mol/L HCl 1 mL终止反应，299 nm处测定吸光度（Ai），空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品（A0），清除率计算公式［18］：

式中：A0为空白的吸光度；Ai为样品吸光度。

1.3.4数据处理与分析

试验采用3个重复，每个重复平行测定3次，使用SPSS 15.0统计软件和Excel 2003进行统计分析。

2结果与分析

2.1菠萝蛋白酶水解猪皮胶原蛋白正交组合优化试验结果

菠萝蛋白酶水解猪皮胶原蛋白正交组合优化试验结果见表6。

表6　菠萝蛋白酶正交试验结果及分析Table 6Results and analysis of orthogonal experiments of Bromelain

在菠萝蛋白酶水解猪皮胶原蛋白正交试验中，pH、酶与底物比、温度、时间4个因素对DH的影响顺序为：pH＞时间＞酶与底物比＞温度，但4个因素对DH的影响都不显著（P＞0.05）；各因素对O2-·清除率的影响顺序为pH＞酶与底物比＞时间＞温度。通过对两个指标的极差和方差分析，选择A2B1C1D1为最优组合。验证试验测得在最适条件下水解液的DH为5.25%，O2-·清除率为44.49%。

2.2木瓜蛋白酶水解猪皮胶原蛋白正交组合优化试验结果

木瓜蛋白酶水解猪皮胶原蛋白正交组合优化试验结果见表7。

表7　木瓜蛋白酶正交试验结果及分析Table 7Results and analysis of orthogonal experiments of Papain

在木瓜蛋白酶水解猪皮胶原蛋白正交试验中，pH、酶与底物比、温度、时间4个因素对DH的影响顺序为：温度＞酶与底物比＞时间＞pH，4个因素对水解度的影响都不显著（P＞0.05）；各因素对O2-·清除率的影响顺序为pH＞酶与底物比＞时间＞温度。通过对两个指标的极差和方差分析选择A3B1C3D3为最优组合。验证试验测得在最适条件下水解液的DH为13.28%，O2-·清除率为41.97%。

2.3中性蛋白酶水解猪皮胶原蛋白正交优化试验结果

中性蛋白酶水解猪皮胶原蛋白正交组合优化试验结果见表8。

表8　中性蛋白酶正交试验结果与分析Table 8Results and analysis of orthogonal experiments of Neutral Protease

中性蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的正交试验中，温度、酶与底物比、pH、时间4个因素对DH的影响顺序为：温度＞酶与底物比＞pH＞时间，但4个因素对水解度的影响都不显著（P＞0.05）；4个因素对O2-·清除率的影响顺序为时间＞酶与底物比＞温度＞pH。通过对两个指标的极差和方差分析，选择A1B1C2D3为水解胶原蛋白的最优组合。验证试验测得在最适条件下水解液的DH为8.45%，O2-·清除率为69.79%。

2.4胃蛋白酶水解猪皮胶原蛋白正交组合优化试验结果

胃蛋白酶水解猪皮胶原蛋白正交组合优化试验的结果见表9。

表9　胃蛋白酶正交试验结果及分析Table 9Results and analysis of orthogonal experiments of Pepsin

胃蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的正交试验中，温度、酶与底物比、pH、时间4个因素对DH的影响顺序为：时间＞温度＞pH＞酶与底物比，但4个因素对水解度的影响都不显著（P＞0.05）；4个因素对O2-·清除率的影响顺序为时间＞酶与底物比＞温度＞pH值。通过对两个指标的极差和方差分析，选择A1B1C2D3为水解胶原蛋白的最优组合。验证试验测得在最适条件下水解液的DH为4.47%，O2-·清除率为48.49%。

2.5胰蛋白酶水解猪皮胶原蛋白正交组合优化试验结果胰蛋白酶水解猪皮胶原蛋白正交组合优化试验的结果见表10。

表10　胰蛋白酶正交试验结果及分析Table 10Results and analysis of orthogonal experiments of Bromelain

胰蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的正交试验中，温度、酶与底物比、pH、时间4个因素对水解度的影响顺序为：酶与底物比＞温度＞pH＞时间；4个因素对O2－·清除率的影响顺序为：时间＞酶与底物比＞温度＞pH。通过对两个指标的极差和方差分析，选择组合A1B1C2D3为最优组合。验证试验测得在最适条件下水解液的DH为12.15%，O2－·清除率为76.49%。

3结论与讨论

1）不同蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的最适条件不同，其中菠萝蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的最适条件：时间5 h、温度45℃、pH3.5、酶与底物比4 000 U/g、底物浓度6%，此时DH 5.25%，O2－·清除率44.49%；木瓜蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的最适条件：时间6 h、温度70℃、pH5、酶与底物比6 250 U/g、底物浓度6%，此时DH13.28%，O2－·清除率41.97%；中性蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的最适条件：时间5h、温度30℃、pH7.5、酶与底物比2000 U/g、底物浓度6%，此时DH8.45%，O2－·清除率69.79%；胃蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的最适条件：时间5 h、温度30℃、pH3、酶与底物比4 000 U/g、底物浓度8%，此时DH4.47%，O2－·清除率48.49%；胰蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的最适条件：时间5 h、温度40℃、pH9、酶与底物比2 000 U/g、底物浓度10%，此时DH12.15%，O2－·清除率76.49%。

2）五种蛋白酶水解猪皮胶原蛋白的水解产物均具有抗氧化性，但不同蛋白酶水解后的产物的抗氧化活性强弱不同。用不同的酶水解同一种胶原蛋白，因为酶的作用位点不同，所得的水解产物的氨基酸组成不同，也影响其抗氧化性的发挥。不同的水解条件影响胶原蛋白的水解程度，所得的水解产物的分子质量以及氨基酸组成不同，从而影响它的抗氧化性［19］。水解产物的抗氧化活性与蛋白酶种类、水解条件的关系有待进一步深入研究。

3）不同蛋白酶在其最适水解条件下对猪皮胶原蛋白的水解度依次为：木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞菠萝蛋白酶＞胃蛋白酶。不同蛋白酶水解后的产物对O2－·清除率依次为：胰蛋白酶水解产物＞中性蛋白酶水解产物＞胃蛋白酶水解产物＞菠萝蛋白酶水解产物＞木瓜蛋白酶水解产物。这与王运改等［20］、姚东瑞等［21］的研究结果一致，水解物的水解度与抗氧化活性之间没有显著的相关性。

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Hydrolyzing Effect Comparative Studies of Five Proteases on Pigskin Collagen

XIAO Lan1，2，LI Cheng1，*，FU Gang1，YU Xia1，DU Xin1，LI Xi-ran1
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，Sichuan，China；2.Department of Food Science，Sichuan Tourism University，Chengdu 610100，Sichuan，China）

With fresh pigskin as material，five different proteases including neutral protease，bromelain，pepsin，papain，trypsin were used to hydrolyze collagen.Taking DH and scavenging rate of O2－·as index，the condition of the five proteases hydrolyzing pigskin collagen was optimized according to single factor and orthogonal test，and comparatively study the five proteases effect on pigskin collagen.It turned out that：hydrolysates of the five proteases were all anti-oxidative，and the scavenging rates of O2－·were as follows：trypsin＞neutral protease＞pepsin＞bromelain＞papain.

neutral protease；bromelain；pepsin；papain；trypsin；hydrolyzing degree；scavenging rate of O2－·

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.003

2014-02-27

四川省教育厅项目（12ZB102）

肖岚（1981—），女（汉），讲师，博士研究生，从事畜产品加工与质量安全方面研究。

李诚（1964—），男，教授，博导，研究方向：畜产品加工与质量安全。