一种复合萃取物对黄嘌呤氧化酶抑制作用研究

赵玲，陈旅翼，李赫宇

（1.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023；2.中南民族大学药学院，湖北武汉430074；3.天津市益倍建生物技术有限公司，天津300457）

一种复合萃取物对黄嘌呤氧化酶抑制作用研究

赵玲1，陈旅翼2，李赫宇3

（1.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023；2.中南民族大学药学院，湖北武汉430074；3.天津市益倍建生物技术有限公司，天津300457）

一种复合萃取物主要由葡萄皮、葡萄籽、红酒萃取物及人参、枸杞萃取物组成，针对该复合物抑制黄嘌呤氧化酶的体外活性开展了研究，发现该复合物为黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）竞争性抑制剂，其Ki值为53.0 μg，IC50为56.86 μg/mL。

复合萃取物；黄嘌呤氧化酶；抑制作用

高尿酸血症和痛风的生化基础是体液中尿酸浓度过高，降低过高的尿酸是其主要治疗策略［1］。黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）是尿酸生成的关键酶，其催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸，同时产生大量的超氧阴离子和过氧化氢等活性氧，因此，XO为良好的高尿酸血症和痛风治疗靶点。XO抑制剂通过抑制体内XO的活性而减少尿酸生成，如别嘌醇，已于20世纪60年代用于临床，对高尿酸血症和痛风产生良好的防治效果［2-3］。近年又发现，XO抑制剂对缺血再灌注损伤、内皮损伤、心功能衰竭具有明显的保护作用，有可能成为心血管系统疾病的治疗药物［4］。虽然针对该靶点的抑制剂有其现实和潜在的价值，但该类药物品种极其少，且均有不同程度的毒副作用，限制了其应用，因此寻找对XO有抑制作用的天然复合萃取物对人类健康有着非常重要的意义。

本文中复合萃取物主要由葡萄皮、葡萄籽、红酒萃取物及人参、枸杞萃取物组成，本文针对该复合物抑制XO的体外活性开展了研究。

1材料与方法

1.1药品与试剂

复合萃取物样品：由天津市益倍建生物技术有限公司提供；黄嘌呤：Sigma，USA；尿酸：Sigma，USA；黄嘌呤氧化酶：Sigma5U，USA；别嘌醇片（批号：20140908）：江苏方强制药厂有限责任公司；磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸、氢氧化钠、二甲基亚砜等均为分析级。

1.2仪器

BS124S型电子天平：Sartorius Corporation，Germany；Mini-shaker培养板振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；WH-2型漩涡混合仪：上海沪西分析仪器厂；DZF-6020型真空干燥箱：上海一恒科技术有限公司；DG5033A型酶标仪：华东电子；96孔细胞培养板：CorstarRCorporation，USA；20、200、1000 μL移液器：Thermo Electron Corporation，USA。

1.3方法

1.3.1溶液的配制

称取复合萃取物样品适量，150 μL DMSO溶解，再用缓冲盐溶液稀释至浓度为228、114、57、28.5 μg/mL，终浓度为0.034、0.068、0.136、0.272 μg/mL的别嘌醇作为阳性对照。

磷酸缓冲液的配制（pH=7.5，50 mmol/L，按《中华人民共和国药典》2010年版附录配制）：即精密称取在（115±5）℃干燥2 h～3 h的无水磷酸氢二钠3.55 g与磷酸二氢钾3.40 g，加水使溶解并稀释至1 000 mL，用0.1 mol/L的NaOH调pH至7.5。

黄嘌呤溶液的配制：称取2.28 mg溶解于100 mL缓冲液中。EDTA配制：称取0.372g溶解于100mL缓冲液中。XO配制：5U溶解于25mL缓冲液中，得0.2U/mL。

1.3.2体外抑制XO活性测定

酶活力测定：在适宜条件下，黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸，产物尿酸290 nm处有特征吸收峰，因此以290 nm处OD值来说明药物对酶活力的影响。在酶标板中，加入缓冲溶液、底物溶液、酶溶液，反应20 min后，测定290 nm处OD值。

样品测定：按1.3.2的测定方法，在酶促反应体系中加入适量样品溶液，反应20 min后，测定OD值。每个样品平行操作3次，取其平均值计算IC50值。

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空白对照：同上述操作，加与样品同体积的DMSO，不加样品和XO。

XO对照测定：方法与样品测定相同，不加样品。

阳性对照品：为核对试验方法与结果的可信性，取已配制好的不同浓度的别嘌醇溶液，重复上述试验，计算IC50值。

测定顺序如下：

用移液枪按如下顺序吸取试剂于96孔板内：①0.285 mL缓冲液（50 mmol/L磷酸氢二钾缓冲液pH= 7.5），②0.25 mL样品溶液，③0.1 mL EDTA（1 mmol/L缓冲溶液配制），④0.330 mL黄嘌呤溶液，⑤0.035 mL XO溶液，⑥37℃反应20 min后，290 nm测定吸收值。

1.3.3尿酸标准曲线建立

表1　尿酸系列溶液配制Table 1Uric acid series solution preparation

续表1尿酸系列溶液配制Continue table 1Uric acid series solution preparation

表2　尿酸标准曲线Table 2Uric acid standard curve

每一浓度取0.2 mL于96孔板中，混匀后，290 nm处测吸光度，以测得的吸光度为纵坐标，尿酸浓度为横坐标，获得标准曲线Y=0.037 6x+0.003 2（R2= 0.999）。

图1　尿酸标准曲线Fig.1Uric acid standard curve

2结果与分析

2.1体外XO活性测定

以抑制率为因变量，以样品浓度为自变量，采用SPSS 11.5统计软件包计算回归方程，根据回归方程计算抑制率为50%的样品浓度IC50。试验结果见表3。

2.2酶抑制动力学分析（Lineweaver-Burk plots）

酶抑制动力学实验能进一步确定化合物抑制酶的特性，其测定方法为，同一样品浓度对不同底物（黄嘌呤）浓度（0、0.304、0.456、0.608、1.064、1.216、1.976、3.040 μg/mL），同一底物浓度（黄嘌呤）对不同样品浓度（228、114、57、28.5 μg/mL），在反应体系中进行反应，测得一系列OD值。用Diox绘图法计算Ki值，判断抑制剂类型。在不同浓度的底物下，以反应速率的倒数为因变量，样品浓度为自变量，得到一条直线。采用SPSS 11.5统计软件包计算回归方程。求出四直线的交点，可得到抑制动力学参数Ki。再由直线的斜率对相应的底物浓度的倒数二次作图，即可判断抑制剂类型。试验结果表明该复合萃取物为XO竞争性抑制剂，其Ki值为53.0 μg，见表3。

表3　复合萃取物抑制XO的IC50与Ki（n=3）Table 3The IC50and Ki of the XO inhibition of the extractive complex

3结论

通过本论文研究发现该复合萃取物具有较好的抑制XO活性，其IC50为56.86 μg/mL。虽然该复合萃取物没有别嘌醇效果明显，但在人们生活质量日益提高及对健康迫切需求的时代，天然健康的食品及复合萃取物已越来越受到人们的喜爱，服用天然植物萃取物作为调节身体健康的补充剂已成为时尚。因此，将该复合萃取物开发为天然防治痛风的保健食品具有极大的前景，其在体内对XO的抑制作用，将在后续的试验中进一步验证。

［1］朱深银，周远大，刘庆山，等.黄嘌呤氧化酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用［J］.中国药学杂志，2007，42（3）:187-190

［2］祁鑫，王昌禄，李风娟，等.常见蔬菜提取物对黄嘌呤氧化酶抑制作用的筛选研究［J］.现代食品科技，2011，27（5）:511-514

［3］吴新荣，臧路平，刘志刚.抗高尿酸血症药物作用靶点研究进展［J］.中国药理学通报，2010，26（11）:1414-1417

［4］BAKER J F，KRISHNAN E，CHEN L，et al.Serum uric acid and cardiovascular disease:recent developments，and where do they leave us［J］.Am J Med，2005，118（8）:816-826

Study on Inhibition of Xanthine Oxidase of An Extractive Complex

ZHAO Ling1，CHEN Lü-yi2，LI He-yu3
（1.College of Pharmaceutical engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China；2.College of Pharmacy，South-central University For Nationalities，Wuhan，430074，Hubei，China；3.Tianjin Ubasic health Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

An extractive complex contains the extraction of grape skin，grape seed，red wine，ginseng and wolfberry.The complex inhibition in vitro activity of xanthine oxidase conducted research and found that the complex is a xanthine oxidase（xanthine oxidase，XO）competitive inhibitor with Ki values of 53.0 μg and IC5056.86 μg/mL.

extractive complex；xanthine oxidase；inhibit effect

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.049

2015-07-17

赵玲（1982—），女（汉），副教授，博士研究生，研究方向：天然活性成分研究。