环介导等温扩增技术在食品检测中的应用

冯唐锴，江雪，韩文华

（景德镇学院生物与化学工程系，江西景德镇333000）

环介导等温扩增技术在食品检测中的应用

冯唐锴，江雪，韩文华

（景德镇学院生物与化学工程系，江西景德镇333000）

环介导等温扩增技术是一种新兴的核酸扩增技术，被广泛用于生物特异性核酸片段的检测。该技术在食品检测中扮演着越来越重要的角色。简介环介导等温扩增技术的基本原理，并对该技术在食品病原体检测和转基因食物检测等方面的应用进行综述。

环介导等温扩增；核酸；食品；检测

核酸扩增是生命科学领域最重要的技术手段之一，截止到2015年，使用最广泛的核酸扩增技术是聚合酶链式反应（PCR），此外还有环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）［1］等技术。LAMP技术使DNA扩增时间缩短到1 h以内，且灵敏度高、专一性强、操作简便，十分适合用于食品或食源生物中特定核酸序列的检测。

1LAMP技术简介

1.1LAMP特异性引物的设计

靶序列选择和引物设计是LAMP技术成败的关键。靶序列通常为被检生物的特异性核酸片段，长度一般在300 bp以内，最好为130 bp～200 bp。选定靶序列后，即可如图1所示开始设计引物。首先在靶序列（+）链选取6个特异区域（F3c、F2c、F1c，B1、B2、B3），其中F2c和B2为待扩增片段两端长度为18 nt～24 nt的特异序列，F1c和B1为位于F2c和B2内侧的特异序列，且与F2c和B2相距约40 nt，长度18 nt～24 nt。F3c和B3为分别位于F2c和B2外侧长度为17nt～21nt的特异序列。（-）链中有六段与（+）链选定序列互补的区域（F3、F2、F1、B1c、B2c、B3c）。然后根据这些特异序列设计LAMP引物组，其中包括2条较长的内引物和2条较短的外引物。图1中F3和B3即为外引物，内引物分别被称为FIP和BIP，FIP包含F1c和F2，其序列特征为5′-F1c-TTTT-F2-3′；BIP包含B1c和B2，序列特征为5′-B1c-TTTT-B2-3′，其中4个连续的T是多聚胸腺嘧啶核苷酸连接子［1］。LAMP引物设计相当复杂，通常在确定靶序列之后可借助PrimerExplorerV4软件或LAMP引物设计在线网站（http：//primerexplor－er.jp/e/）辅助设计［2］。

图1　靶序列上6对特异区域及其相关引物设计Fig.1The 6 specific areas in the target sequence and related primers Design

1.2LAMP反应过程

LAMP是特殊的DNA聚合酶（通常为BstDNA聚合酶）在体外扩增特定DNA片段的一种方法，反应通常分为3个阶段。第一阶段为原料底物准备阶段（即哑铃状模板合成阶段）；第二阶段为循环扩增阶段；第三阶段为伸长和再循环阶段。第一阶段的反应需要外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，该阶段形成了一条两端环状的单链，又称“哑铃结构”。扩增阶段哑铃结构的DNA通过自我引导完成延伸，生成双链茎环结构。最后的伸长和再循环阶段可在之前的基础上扩增出一系列多环花椰菜样复杂结构的DNA片段混合物［1］。

1.3LAMP反应体系

LAMP反应体系包括靶序列模板DNA、引物、DNA聚合酶、缓冲液和dNTP等。反应总体积一般为25 μL，其中模板DNA总量控制在10-23mol以内；内引物FIP和BIP各0.8 μmol/L，外引物F3和B3各0.1 μmol/L～0.2 μmol/L，外引物的浓度一般是内引物的1/4～1/10；DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或BcaBEST DNA聚合酶，体系中总量控制在133.4 nkat～166.7 nkat［1］。LAMP缓冲液中通常还需要加入破坏DNA双螺旋稳定性的物质以提高反应速率和特异性。

2LAMP技术在食品检测中的应用

LAMP技术作为一种检测手段，在实践应用当中充分显示了灵敏度高、特异性强、速度快、设备简单以及产物检测方便等优势。截至2015年，该技术广泛应用于各种DNA和RNA样品的检测，下面主要介绍该技术在食品检测领域的最新研究及应用。

2.1LAMP技术对食源致病菌的检测

LAMP技术检测食源性致病菌的研究不断增多，技术方法也相对成熟。以下是利用LAMP技术检测几种代表性菌种的方法。

利用LAMP技术检测大肠杆菌的研究最为广泛和成熟。针对不同类型的大肠杆菌，可选取不同靶序列设计引物，开展专门检测。罗海等［3］选用不耐热型产肠毒素大肠杆菌的不耐热肠毒素（LT）基因的保守区设计引物，建立了LAMP技术快速检测的方法。刘道亮等［4］针对肉类中的大肠杆菌O157∶H7，利用其特异性抗原rfbE基因及鞭毛H7特异性抗原fliC基因作为靶序列，设计了2套增加了环引物的改良LAMP引物序列建立快速检测方法，肉眼即可观察结果，实现了单管同时检测。

多种类别的沙门氏菌可导致人畜局部感染性化脓，引起败血症，甚至诱发死亡。万进等［5］以沙门氏菌高度保守的fimY基因为靶序列设计引物，建立LAMP反应体系。阳性菌株检出率100%，该技术对牛奶中沙门氏菌污染的快速检测相当灵敏。张宏伟等［6］则利用该菌种的invA基因设计引物，构建的LAMP体系同样能对食品中沙门氏菌进行很好的检测。

葡萄球菌是一种革兰氏阳性球菌，少数可致病且为最常见的化脓性球菌。最常见的是金黄色葡萄球菌，该菌种的LAMP检测方法较多，蔡克周等［7］利用LAMP方法检测了猪血中的金黄色葡萄球菌。刘伟等［8］同样建立了其他食品金黄色葡萄球菌LAMP检测的成熟方法。凝固酶阳性葡萄球菌可引起人的局部化脓感染，也可引起肺炎、败血症等多种疾病。张宏伟等［9］利用此菌种特有的coa基因设计引物，建立了特异性好、检出率高的LAMP检测方法。

副溶血性弧菌是一种寄生于各种水产品的有害菌，是引起人类食物中毒的重要病原体之一。张毅等［10］将LAMP技术与叠氮溴化乙锭染色观察相结合，以副溶血性弧菌tlh基因作为靶序列设计特异性引物，建立了快速检测食品中副溶血性弧菌的方法。他们还利用该法实现了克氏螯虾寄生副溶血性弧菌的检测，其结果与国家标准检测方法一致［11］。

阪崎肠杆菌能引起新生儿脑膜炎、小肠结肠炎等，且感染死亡率高。张宏伟等［12］利用阪崎肠杆菌16S-23S rDNA间区（ITS）序列设计特异性引物建立LAMP检测方法，该法对奶粉样品阪崎肠杆菌检测低限达1.2 CFU/100 g。柏建山等［13］也用类似方法对宠物乳粉阪崎肠杆菌进行了检测，同样取得了较好结果。

除了上述菌种以外，LAMP技术还可用于志贺氏菌［14］、单增李斯特氏菌［15］、铜绿假单胞菌［16］、耐热芽孢菌［17］、溶藻弧菌［18］、霍乱弧菌［19］等多种细菌的检测。

2.2LAMP技术对食源致病病毒的检测

食源病毒主要存在于家禽、家畜、水产、蔬菜活体中，易导致其大量死亡，造成经济损失。自Pham等［20］将逆转录方法和LAMP技术联用形成RT-LAMP技术，并用于鸡新城疫病毒快速诊断之后，该技术便被广泛应用于各类农产品活体中各类病毒的检测。

2.2.1家禽病毒检测

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）能引起的禽类流感，给世界养禽业造成了巨大损失。该病毒是RNA病毒，可分为16个HA亚型，有些亚型可以感染到人，甚至造成死亡。RT-LAMP技术检测禽流感病毒的灵敏性也很高，适用于农场大规模家禽检测［21］。成思佳等［22］针对H1N1亚型禽流感病毒的M基因和HA基因设计了两组特异性引物，建立了RT-LAMP单管快速检测方法，反应结果通过浊度或SYBR Green N荧光进行判定，最低可检测到10拷贝/管病毒颗粒。彭宜等［23］分别针对禽流感病毒H1亚型的HA基因及N1、N2亚型的NA基因设计了3套LAMP特异性引物，实现了上述3种亚型病毒的可视化检测。李启明等［24］也建立了敏度达10拷贝RNA分子水平的H5N1亚型的RT-LAMP检测方法。彭宜等［25］和但晓雅等［26］各自利用H9亚型HA基因设计引物，建立和改良了适用于H9亚型的RT-LAMP快速检测方法。

除禽流感外，RT-LAMP技术同样可用于其他禽类病毒的检测。鹅副黏病毒会引起鹅消化道急、烈性传染病。鲜思美等［27］针对该病毒F基因设计引物，建立了RT-LAMP检测方法。鹅细小病毒又称小鹅瘟病毒，是严重危害鹅鸭养殖的传染病源。傅秋玲等［28］针对该病毒VP3基因设计引物，建立了RT-LAMP检测方法。禽呼肠孤病毒主要引发多种禽类的心包炎、肝炎等各种疾病。马利等［29］针对该病毒p10基因设计引物，建立了使用SYBR GreenⅠ钙黄绿素荧光显示结果的LAMP检测方法。

2.2.2其他动物类病毒的检测

陈长木等［30］运用RT-LAMP技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，其结果和传统RT-PCR方法检测结果的符合率为96.2%。秦智锋等［31］建立了1套针对口蹄疫病毒的LAMP检测方法，该法可特异性检出多个类型的口蹄疫病毒，与其它病毒无交叉反应，其灵敏度与实时荧光RT-PCR相当，肉眼可直接观察结果。杨慧等［32］采用LAMP技术检测犬细小病毒具有良好的特异性，最低检出量达9.3×10-5ng/μL。在水产品检疫中，Gunimaladevi等［33］首先用RT-LAMP方法检测虹了鳟鱼及鲑鱼中的传染性造血器官坏死病毒，灵敏度比套式PCR方法高10倍。此外，LAMP还可用于对虾黄头病病毒［34］、对虾白斑综合症病毒［35］、鱼类虹色病毒［36］等许多水产品活体病毒的检测。

2.2.3菜蔬等植物病毒的检测

除禽、畜病毒外，LAMP技术同样能用于蔬菜病毒检测。番茄黄化曲叶病毒能引番茄、烟草、南瓜、木薯、棉花等重要经济作物生长缓慢，植株严重矮缩，无法正常开花结果，对农业生产造成毁灭性危害。Fukuta等［37］针对该病毒高度保守序列设计了LAMP引物，建立了高效便捷的检测方法，灵敏度达传统PCR法的100倍。

2.3LAMP技术对转基因食品的鉴定

当前社会对是否推广转基因食品存在较大争议，建立灵敏易行的转基因食品鉴定方法显得尤为必要。LAMP技术在这方面也能发挥重大作用，相关研究已取得了较大进展。LAMP技术检测转基因食品的靶基因可以是被转化的基因本身，也可以是转基因常用的启动子。大多数转基因食品都含有CaMV-35S启动子，因此检测该启动子的存在与否可判断食品是否为转基因。Fukuta等［38］就利用这一原理设计了转基因食品的LAMP鉴定方法，肖维威等［39］将该法进一步推广到大豆、玉米、油菜、甜菜等多种转基因食品的检测上。闫兴华等［40］利用外源cordapA基因设计LAMP特异引物，对转基因玉米LY038进行了检测。于妍等［41］针对人工改造的外源cry1Ac基因设计LAMP特异引物，并利用荧光显色对转入该基因的水稻“华恢1号”进行了鉴定。蔡颖等［42］根据外源插入片段与植物基因组序列设计和筛选了品系特异性引物，建立了转基因大豆A5547-127品系的LAMP快速检测方法。

2.4LAMP技术的其他应用

刘昊等［43］利用开心果过敏原Pisv1基因设计LAMP引物，建立了食物过敏原成分的LAMP检测方法。Karanis P等［44］则首次将LAMP技术应用到对隐孢子虫检测上，开辟了食品中寄生虫检测的新途径。

3小结

LAMP技术理论设计巧妙，实践操作上具有特异性好、灵敏度高、快速便捷、易于观察及容易推广等特点，这使得该技术在食品检测方面的应用越来越广泛。靶序列的选择及引物的设计是LAMP成败的关键，实验条件的优化是LAMP方法建立的必要过程。LAMP技术检测结果可用传统电泳方法观察，反应后的浑浊度和沉淀量也可直接用肉眼观察，引入各种荧光染料则能进一步提高观测效果。针对RNA对象的检测，则必须进一步建立完善的RT-LAMP方法。该技术也存在其缺点，如不能完整扩增较大基因片段，只能作为一种简单检测手段使用。希望能够通过技术创新，将该技术进一步推广到更加广阔的基因操作领域。

［1］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（12）:E63

［2］沙才华，徐博文，廖秀云，等.浅谈环介导等温扩增技术及其在动物病毒病检疫中的应用［J］.兽医研究，2013，294（10）:6-7

［3］罗海，郑春亮，万红梅，等.环介导等温扩增法快速检测产肠毒素大肠杆菌的研究［J］.食品研究与开发，2010，31（7）:127-130

［4］刘道亮，胡连霞，赵占民，等.改良环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌O157:H7［J］.微生物学通报，2011，38（3）:430-435

［5］万进，张璐，曹兴元.环介导等温扩增技术对牛奶中沙门氏菌快速检测的研究［J］.农产品质量与安全，2012（增刊）:71-75

［6］张宏伟，叶露萌，彭杨思.利用环介导等温扩增技术对沙门氏菌进行检测［J］.食品研究与开发，2009，35（5）:115-118

［7］蔡克周，薛崇浪，张旻，等.环介导等温扩增检测猪血中金黄色葡萄球菌［J］.肉类研究，2012，26（11）:27-30

［8］刘伟，蔡国瑞，刘国红，等.等温扩增技术在检测食品中金黄色葡萄球菌的应用［J］.食品研究与开发，2013，34（24）:225-228

［9］张宏伟，刘伟，侯丽萍，等.LAMP法检测食品中凝固酶阳性葡萄球菌［J］.食品研究与开发，2011，32（5）:126-130

［10］张毅，王爱华，王贵春.EMA-LAMP方法快速检测食源性副溶血性弧菌活细胞［J］.江苏农业科学，2012，40（10）:290-292

［11］张毅，胡定金.环介导等温扩增技术检测克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌［J］.河南农业科学，2013，42（3）:128-130

［12］张宏伟，于佳，郑文杰，等.利用环介导等温扩增技术对奶粉中阪崎肠杆菌进行检测［J］.食品研究与开发，2009，30（6）:114-117

［13］柏建山，简志华，伍朝晖，等.环介导等温扩增法检测进口宠物乳粉中阪崎肠杆菌［J］.中国卫生检验杂志，2011，21（3）:620-621

［14］祁军，张霞，蒋刚强，等.交叉引物等温扩增技术检测志贺氏菌［J］.食品研究与开发，2013，34（11）:65-68

［15］刘旸，张海英，刘国红，等.单增李斯特氏菌快速检测方法的建立［J］.食品研究与开发，2012，33（9）:134-136

［16］刘伟，侯丽萍，赵良娟，等.环介导等温扩增技术检测食品中铜绿假单胞菌［J］.食品研究与开发，2012，33（5）:140-142

［17］窦明理，霍贵成.环介导等温扩增技术快速检测食品中的耐热芽孢菌［J］.食品安全与检测，2012，37（12）:320-324

［18］徐义刚，吴岩，刘忠梅，等.基于DNA环介导等温扩增技术快速检测溶藻弧菌的研究［J］.中国畜牧兽医，2013，40（4）:72-76

［19］匡燕云，叶卫翔，吕敬章，等.霍乱弧菌环介导等温扩增LAMP技术检测［J］.中国公共卫生，2009，25（11）:1310-1312

［20］Hang Minh Pham，Chie Nakajima，Kazuhiko Ohashi，et al.Loop-Mediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of Newcastle Disease Virus［J］.Journal of clinical microbiology，2005，43（4）:1646-1650

［21］Poon LL，Leung CS，Chan KH，et al.Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification［J］.J Clin Microbiol，2005，43（1）:427-430

［22］成思佳，陈之遥，初亚男，等.单管高灵敏度等温扩增技术快速检测甲型H1N1流感病毒［J］.分析化学，2011，39（3）:335-340

［23］彭宜，谢芝勋，郭捷，等.利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型［J］.病毒学报，2013，29（2）:154-161

［24］李启明，马学军，高寒春，等.逆转录环介导等温核酸扩增技术（RT-LAMP）在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用［J］.病毒学报，2008，24（3）:18-24

［25］彭宜，谢芝勋，刘家波，等.H9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立［J］.中国人兽共患病学报，2011，27（1）:19-23

［26］但晓雅，董英，邹明强，等.改良逆转录环介导等温扩增检测技术快速实时检测H9亚型禽流感病毒［J］.生物技术通报，2012，28（8）:125-129

［27］鲜思美，韦洪才，尹强军，等.鹅副黏病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用［J］.生物技术通报，2012，28（11）:150-154

［28］傅秋玲，施少华，万春和，等.检测鹅细小病毒环介导等温扩增方法的建立及结果判定方法改进［J］.福建农业学报，2013，28（1）:9-13

［29］马利，张琳，张秀美，等.基于荧光显色的环介导等温扩增技术（LAMP）检测禽呼肠孤病毒［J］.中国兽医学报，2013，33（2）:166-170

［30］陈长木，崔尚金，张超范，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒反转录环媒恒温检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2009，31（5）:378-382

［31］秦智锋，曾少灵，阮周曦，等.口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2008，30（5）:63-65

［32］杨慧，曲光刚，赵元楷，等.犬细小病毒LAMP检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2010，32（7）:550-553

［33］Gunimaladevi I，Kono T，Lapatra SE，et al.A loop mediated isothermal amplification（LAMP）method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus（IHNV）in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）［J］.Arch Virol，2005，150（5）:899-909

［34］Mekata T，Kono T，Savan R，et al.Detection of yellow head virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification（LAMP）［J］.J Virol Methods，2006，135（2）:151-156

［35］Tomoya Kono a，Ram Savan b，Masahiro Sakai，et al.Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification［J］.Journal of Virological Methods，2004，115（2）:59-65

［36］Christopher Marlowe A Caipang，Ikumi Haraguchi，Tsuyoshi Ohira，et al.Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification（LAMP）［J］.Journal of Virological Methods，2004，121（1）:155-161

［37］Fukuta S，Kato S，Yoshida K，et al.Detection of tomato yellow leaf curl virus by loop-mediated isothermal amplification reaction［J］.J Virol Methods，2003，112（2）:35-40

［38］Shiro Fukuta，Yuko Mizukami，Akira Ishida，et al.Real-time loopmediated isothermal amplification for the CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modified organisms［J］.Eur Food Res Technol，2004，218（5）:496-500

［39］肖维威，周琳华，吴永彬，等.LAMP技术检测食品中转基因成分CaMV35S启动子的研究［J］.中国食品学报，2013，13（4）:149-155

［40］闫兴华，许文涛，商颖，等.环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测转基因玉米LY038［J］.农业生物技术学报，2013，21（5）:621-626

［41］于妍，李志辉，王志鑫，等.转cry1Ac基因抗虫水稻环介导等温扩增检测方法的建立及应用［J］.河北农业大学学报，2013，36（4）:86-91

［42］蔡颖，周广彪，刘津，等.转基因大豆A5547-127品系成分LAMP快速检测方法的建立［J］.食品研究与开发，2013，34（17）:69-74

［43］刘昊，黄文胜，邓婷婷，等.LAMP法检测食品中开心果过敏原成分［J］.食品科学，2013，34（22）:128-132

［44］Karanis P，Thekisoe O，Kiouptsi K，et al.Development and preliminary evaluation of a loop-mediated isothermal amplification procedure for sensiteve detection of Cryptosporidiumoocysts in fecal and water samples［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73（17）:5660-5662

The Application of Loop-mediated Isothermal Amplification Technology in Food Detection

FENG Tang-kai，JIANG Xue，HAN Wen-hua
（The Department of Biology and Chemistry，Jingdezhen University，Jingdezhen 333000，Jiangxi，China）

Loop mediated isothermal amplification technology is a kind of new technology in nucleic acid amplification.It is widely used in biological specific nucleic acid detection.This technology has been playing an increasingly important role in food detection.Introduces the basic principle of loop mediated isothermal amplification technology，and reviews the application of the technology in the detection of food borne pathogens and genetically modified food detection.

loop mediated isothermal amplification；nucleic acid；food；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.044

2014-03-24

冯唐锴（1979—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：食品生物化学与分子生物学。