不同产地市售红花药材指纹图谱的建立*

金荧荧　孙燕雯　何昱

（浙江中医药大学，浙江杭州310053）

·研究报告·

不同产地市售红花药材指纹图谱的建立*

金荧荧孙燕雯何昱△

（浙江中医药大学，浙江杭州310053）

目的建立红花药材的高效液相（HPLC）特征指纹图谱分析方法，为评价和有效控制红花药材的质量提供借鉴。方法收集12批次不同产地的市售红花药材，进行HPLC梯度洗脱分离，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件处理数据，建立红花指纹图谱，并对不同产地红花药材指纹图谱的相似度进行比较分析。结果建立了红花药材的HPLC指纹图谱，标定了25个共有峰，且通过HPLC-MS指认了其中4个共有峰。对12批不同产地的红花药材指纹图谱进行了相似度评价，其相似度在0.679～0.985之间。结论所建立的指纹图谱可为红花药材的质量控制提供一定的依据，并为红花的体内药动学研究提供参考。

不同产地红花指纹图谱HPLC

红花味辛微苦、性温，归心、肝经，是活血通经、祛瘀止痛之良药，主要用于治疗心脑血管类疾病及糖尿病并发症等［1］。红花原植物为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.，主要分布在河南、浙江、四川、云南、新疆等地［2］。笔者在前期研究中发现，市售红花药材在化学组成上存在一定的差异，而已有指纹图谱的研究报道有的药材产地较为局限［3］，有的构建的指纹图谱共有峰较少［4］，难以对红花药材的质量作出全面客观的评价。故本研究收集了全国各地市售的红花药材共12批，建立了红花水提液的高效液相（HPLC）指纹图谱，标定25个共有峰，并对不同产地红花药材指纹图谱的相似度进行评价，较为客观地反映了药材的内在质量；同时为课题项目的下一步，即进行体内多组分的检测、建立体内指纹图谱，以全面探讨红花的体内过程提供了参考依据。

1　实验材料

12个不同批次的红花药材购自全国各药店，由浙江中医药大学陈孔荣副教授鉴定为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，具体产地及批号为：S1新疆塔城，批号121205；S2新疆伊犁，批号120804；S3甘肃酒泉，批号120804；S4新疆哈密，批号121024；S5四川南充，批号100925；S6河南，批号120928；S7四川，批号121009；S8云南，121021；S9新疆伊宁，批号21007；S10新疆昌吉，批号120523；S11新疆阿克苏，批号120523；S12内蒙古固阳，批号121011。羟基红花黄色素A对照品（中国食品药品检定研究院，批号111637-201106），三氟乙酸（科龙化工试剂厂分析纯，批号20110906），乙腈（美国TEDIA公司，色谱纯），水为Millipore超纯水。Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Millipore纯水仪（美国Millipore公司）；AL104电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。

2　.实验方法

2.1色谱条件Alltech Alltima-C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.01%三氟乙酸溶液（B）；梯度洗脱程序：0～5 min，2%A；5～10 min，2%～5%A；10～20 min，5%～11%A；20～30 min，11%～12%A；30～70 min，12%～43%A；70～72 min，43%～2%；流速：1.0 mL/min；柱温：30°C；检测波长：280 nm；进样量：20 μL［4-6］。

2.2供试品溶液的制备精密称取0.5 g红花样品，加入水15 mL，精密称定，60℃温浸提取45 min，冷却后补充丢失的水分，取滤液过0.22 μm滤膜，即得红花水提供试品溶液。

2.3参照物的选择羟基红花黄色素A（HSYA）在红花的水溶性成分中含量最高，为红花的主要活性成分之一，是检验红花品质的指标性成分［7］。在色谱洗脱过程中，HSYA的色谱峰较为明显，并出现在色谱图的中间段，故本试验选用HSYA为参照物。精密称取HSYA对照品5.0 mg，加25%甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，即得0.50 mg/mL的对照品溶液。精密吸取对照品溶液20 μL，按上述色谱条件进行分析，记录保留时间用以确定指纹图谱中参照物的位置。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验精密称取S10的红花样品0.5 g，按2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1色谱条件，连续进样6次，测定记录色谱图，以参照峰的保留时间（25.62 min）和峰面积为参比，计算供试品溶液中各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD。

2.4.2重复性试验取S10的样品平行制备6份供试品溶液，按“2.1色谱条件”进行HPLC分析，以参照峰的保留时间和峰面积为参比，计算供试品溶液中各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD。

2.4.3稳定性试验S10的药材供试品溶液在制备好后室温下放置，分别于0、2、4、8、12、24 h进行HPLC分析，以参照峰的保留时间和峰面积为参比，计算供试品溶液中各共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD。

2.5红花药材指纹图谱的建立分别精密吸取各产地的红花供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录72 min的色谱图，建立样品的HPLC指纹图谱。

2.6不同产地红花药材对照图谱的建立将所得的12个不同产地红花药材的HPLC图谱以AIA格式依次导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件，对各产地红花药材供试品溶液的峰数、峰面积和保留时间等相关参数进行分析，相比于其他11批红花药材，S10的红花药材HPLC图谱中各组分的色谱峰分离度更高，主要组分峰形良好，因此以S10图谱作为参照图谱，时间窗宽度设置为0.1 s，进行多点校正，谱峰匹配后以中位数法生成对照图谱。确定参照峰位置，计算各共有峰的相对保留时间（共有峰与参照峰的保留时间的比值）和相对峰面积（共有峰与参照峰的峰面积的比值）。

2.7不同产地红花药材相似度评价通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件中的“相似度计算”功能进行供试品色谱图谱与对照图谱的相似度评价。

3　结果

3.1方法学考察见表1，表2。

3.1.1精密度试验各共有峰相对保留时间的RSD在0.033%～0.200%之间，相对峰面积的RSD在0.319%～2.769%之间，表明仪器稳定，符合精密度要求。

3.1.2重复性试验各共有峰相对保留时间的RSD在0.073%～0.801%之间，相对峰面积的RSD在0.621%～2.928%，表明方法重复性良好。

3.1.3稳定性试验24 h内供试品溶液中各共有峰相对保留时间的RSD在0.030%～0.351%之间，相对峰面积的RSD在1.258%～3.076%之间，表明样品溶液在24 h内稳定。

3.2共有峰的标定将不同产地的市售红花药材制成供试溶液，按上述色谱条件进行分析，对12批样品的指纹图谱比较，其中25个峰是全部样品所共有的（峰号见图2），并且含量相对较高，各成分之间分离效果良好，确定为共有指纹峰。3号峰的峰形较宽；9号峰为最高峰；11与12号峰，15与16号峰紧密相连，分离不好时出现M峰；13号峰峰形较宽。将样品与HSYA的HPLC图谱进行比较，9号峰与参照峰一致，故确定9号峰为参照峰，记为S。

3.3红花药材的HPLC指纹图谱的建立以9号HSYA参照峰峰面积作1，计算各共有峰的保留时间及峰面积与参照峰的比值，结果见表1及表2，并建立红花水提物的HPLC指纹图谱（图1）。

图1　红花药材HPLC指纹图谱

3.4红花药材对照图谱的建立运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”对12批红花指纹图谱进行分析，以25个共有峰为校正点，建立红花药材的对照图谱，如图2所示。

表1　红花药材指纹图谱共有峰（示相对保留时间）

图2　红花药材的对照图谱

3.5红花药材相似度计算以红花药材的对照图谱为标准，以软件计算得到的12批不同产地样品的相似度分别为0.908、0.967、0.945、0.981、0.950、0.979、0.969、0.975、0.883、0.951、0.679、0.985。

4　讨论

4.1指纹图谱建立条件的选择与优化首先比较了3种不同品牌不同型号的色谱柱：Agilent ZORBAX SBC18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm），AgilentEclipseXDBC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Alltech Alltima-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。结果显示Alltech Alltima-C18色谱柱对红花水溶性成分的分离效果最佳。其次对流动相中的酸进行了考察，包括磷酸、甲酸、乙酸和三氟乙酸，结果表明三氟乙酸对红花水提物中某些较难分离的组分分离效果良好，且峰形也较好。然后对检测波长也进行了考察，分别为210 nm、254 nm、280 nm和403 nm，其中在210 nm和280 nm条件下出峰数最多，但是相对而言280 nm条件下各个成分的峰形较好，分离度较高，因此选择280 nm为检测波长。

4.2红花药材的HPLC-MS分析Fan Li等［8］分离纯化了红花药材中的10种组分，并通过液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）对其进行了分子量的测定。为确定这10个组分是否在图2的共有峰中出现，采用HPLCMS对红花水提物进行了分析。

共有峰相对峰面积均数新疆塔城新疆伊犁甘肃酒泉新疆哈密四川南充河南四川云南新疆伊宁新疆昌吉新疆阿克苏内蒙古固阳10.12260.13140.14620.08260.14500.04620.10890.09030.10110.11650.07020.05160.1010 20.10280.09760.14250.08870.13320.11040.08630.10480.06240.09620.06690.08500.0981 30.06230.04110.04610.02450.06400.05450.02510.02960.02500.02850.02950.08500.0429 40.16200.05940.11570.08460.14870.13870.08800.07820.15140.11290.19170.11710.1207 50.14480.17880.24980.12960.20460.20410.16790.14970.15050.18190.14990.18920.1751 60.10110.06010.10180.06390.10770.09080.05190.06790.07170.09550.09650.07200.0817 70.16110.07550.12950.11030.16780.09600.07210.12740.58360.12660.08411.58580.2767 80.21710.09790.17260.17890.21910.13270.09500.17910.14420.19200.12800.16500.1601 91.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.0000 100.26770.15790.30260.21890.42430.25510.14010.22410.19920.30500.22260.25100.2474 110.28270.10160.21810.12460.33730.18000.09310.13540.16820.19960.20320.13860.1819 120.14340.10240.14830.13460.16680.14980.14760.14930.09690.11500.09730.12310.1312 130.20480.06070.15070.09880.19460.12400.05150.09900.03970.10360.04520.02170.0995 140.13360.08330.08280.07850.09240.07040.06320.08650.06280.07920.06050.06240.0796 150.15640.08030.14940.10560.19110.12680.08530.10710.10660.13060.14760.09660.1236 160.06600.05290.05290.11410.08730.05320.06440.08860.04710.06440.06410.05800.0677 170.16140.10520.12950.13700.07250.22060.09080.15860.16540.15250.17830.13620.1423 180.19510.11610.12400.16640.38780.2780 0.1203 0.21060.18880.13670.22720.20240.1961 190.13270.06100.12470.05590.38780.1034 0.0482 0.06340.10540.11520.12120.07330.1160 200.23390.11910.10260.10770.02100.1778 0.0957 0.13680.02490.17210.03870.03390.1053 210.73580.21030.24960.36340.64660.2951 0.2045 0.33550.04550.38380.09510.14050.3088 220.76290.38490.54650.45530.59830.4862 0.3853 0.47670.35130.45580.40330.40790.4762 230.13810.14300.20710.17190.12280.2317 0.1319 0.19330.14520.28930.17440.12670.1729 240.09060.06700.04740.10780.20360.0929 0.0612 0.10540.03370.04820.03070.04050.0774 250.04840.10380.03290.04570.05540.0811 0.0586 0.04210.07310.03670.06540.07410.0598

图3　红花药材质谱图

根据液质结果（见图3），确定在25个共有峰中存在的是鸟苷（5号峰），羟基红花黄色素A（9号峰），6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄醛酸苷（18号峰）及脱水红花黄色素B（22号峰）。

4.3不同产地市售红花药材相似度评价12个不同产地的市售红花药材中，除产地9和11样品外，其余10个产地的药材相似度均大于0.9，具有较好的一致性。而来自产地9（新疆伊宁）和产地11（新疆阿克苏）的红花药材其相似度仅为0.883和0.679，从外观上看这两个产地的红花颜色较深，其中产地11的红花还掺杂少量泥土。原因可能是这两个产地的红花药材的生长年限、环境等因素对药材的内部质量产生了一定的影响，或者在药材的采摘、加工、储藏、运输等方面的不当操作使其质量有所降低。

［1］郭晓凤.中药红花的研究进展［J］.中国民族民间医药，2008，17（2）：73-74.

［2］杨玉霞，吴卫，郑有良.红花研究进展［J］.四川农业大学学报，2004，22（4）：365-369.

［3］田兰.新疆额敏县红花品质研究及其指纹图谱的分析［D］.乌鲁木齐：新疆医科大学药学院，2006.

［4］范莉，濮润，赵海誉，等.红花药材的HPLC指纹图谱及质量研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：37-39.

［5］宋金春，胡传芹，曾俊芬，等.红花的HPLC指纹图谱研究［J］.中国药学杂志，2005，40（18）：1378-1381.

［6］赵明波，邓秀兰，王亚玲，等.红花RP-HPLC指纹图谱的建立及其质量研究［J］.药学学报，2004，39（3）：212-216.

［7］杨晓君，吴桂荣，王岩.红花有效成分提取工艺研究［J］.新疆医科大学学报，2005，28（1）：45-47.

［8］Fan L，Zhao HY，Xu M，et al.Qualitative evaluation and quantitative determination of 10 major active components in Carthamus tinctorius L.by high-performance liquid chromatographgy coupled with diode array detector［J］.Journal of Chromatography A，2009，12（16）：2063.

The Establishment of HPLC Fingerprint of Commercial Safflower from Different Producing Areas

JIN Yingying，SUN Yanwen，HE Yu.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang，Hangzhou 310053，China

Objective：To develop a HPLC fingerprint method for the quality control of safflower，which offers a reliable method to scientifically evaluate and effectively control the quality of safflower.Methods：12 batches of safflower from different areas were collected，and the gradient elution mode was applied in HPLC chromatographic separation.Data was analyzed by the software"Chromatographic fingerprint evaluation system"in 2004A Edition to establish fingerprint and compare the quality of safflower samples from different habitats.Results：The HPLC fingerprint spectrum of safflower was set up.There were 25 common peaks in safflower，and four of them were identified by HPLC-MS.The similarity evaluation of 12 areas of safflower was carried out，and their similar degrees were between 0.679～0.985.Conclusion：The fingerprint spectrum may provide the basis for quality control of safflower，and supply analysis condition for the study of pharmacokinetics of safflower in vivo.

Different producing areas；Safflower；Fingerprint；HPLC

R282

A

1004-745X（2015）09-1513-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.003

2015-06-27）

国家自然科学基金项目（81373898）；浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目

（电子邮箱：heyu0923@sina.com）