特应性皮炎患儿外周血CD4+T细胞miR-155的表达与疾病严重程度的相关性

陈仕胜 喻苏婷 周鹏飞 金宛宛 马新华 张小婷 高 宇

特应性皮炎患儿外周血CD4+T细胞miR-155的表达与疾病严重程度的相关性

陈仕胜 喻苏婷 周鹏飞 金宛宛 马新华 张小婷 高 宇

目的： 确定特应性皮炎（AD）患儿外周血CD4+T细胞中miR-155的表达与疾病严重程度的相关性。方法： 采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time-PCR）检测45例AD患儿和38例健康者对照外周血CD4+T细胞中miR-155的表达，ELISA法检测血清IL-5和IFN-γ表达，并进行SCORAD评分。结果： AD组miR-155的表达较对照组明显升高（P＜0.05）；AD患者组miR-155的表达与SCORAD评分、血清IL-5表达水平呈正相关（均P＜0.05），与血清IFN-γ表达水平呈负相关（P＜0.05）。结论： AD患儿外周血CD4+T细胞中miR-155表达与疾病严重程度正相关，可作为评定AD严重程度的一个指标。

儿童； 特应性皮炎； miR-155

特应性皮炎是一种慢性炎症性皮肤病，目前认为其发病机制是遗传因素背景下由过敏原诱发的IgE介导的皮肤速发型和迟发型变态反应。Th1/Th2失衡在AD的发生发展中发挥着重要的作用。1microRNA（miRNA）参与许多炎症和自身免疫性疾病的发生与发展。2，3近年来发现miRNA在银屑病和AD皮损中异常表达，其中miRNA-155在AD中呈特异性高表达，说明miRNA-155可能参与AD的免疫反应调控。4然而AD患者PBMCs中是否存在miRNA-155的高表达，及其与AD严重程度的关系，目前还不清楚。本研究通过检测特应性皮炎患儿外周血CD4+T细胞中miR-155的表达，并与特应性皮炎患儿SCORAD评分、血清IL-5和IFN-γ表达水平进行相关性分析，初步探讨miR-155在AD发生发展中的作用。

1　对象与方法

1.1对象 45例AD患儿，符合Hanifin&Rajka AD诊断标准，符合以下纳入标准：病程1年以上，每年缓解期＜3个月者；未发现其他皮肤病和内脏疾病史；停用抗组胺药1周以上；停用系统及局部糖皮质激素及免疫抑制剂1个月以上。对照组38例，均来自我院健康体检中心，无自身免疫性皮肤病或内脏病史，否认家族过敏史。所有受试儿童法定监护人签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会审批通过。

1.2主要试剂与仪器 淋巴细胞分离液（美国Sigma公司），miRNA提取试剂盒（美国Sigma公司），RTPCR试剂盒（美国Promega公司），miR-155引物（美国Invitrogen公司），IL-5 ELISA kit、IFN-γELISA kit（美国R&D systems公司）MACS分选仪（德国Miltenyi Biotec公司），FCX96实时荧光定量PCR检测仪（Bio-Rad公司），流式细胞分析仪（COULTER Epics XL·MCL，美国）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.3研究方法

1.3.1所有患儿由经过SCORAD课程专门培训的一名指定医生评价。参照文献5将AD患儿按照SCORAD评分＜15分为轻度，15～40分为中度，＞40分为重度3组。

1.3.2标本收集及外周血CD4+T细胞的分离 采集病例组和健康对照组外周血10mL，分成两管，每管5 mL，EDTA-K2抗凝，于-20℃存放备用。取其中一管用淋巴细胞分离液分离外周单个核细胞，免疫磁珠分选CD4+T细胞。流式细胞仪最后检测CD4+T细胞纯度。

1.3.3总RNA提取与cDNA合成 采用RNA提取试剂盒从上述CD4+T细胞中提取总RNA，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定RNA的完整性，紫外分光光度仪测定吸光度（A260/280）值。取RNA1μg，逆转录酶1 μL，PolyA聚合酶1μL，5xRT缓冲液4μL，加无RNA酶水补足体积至25μL，于PCR仪42℃ 1h，90℃ 10min。将合成的cDNA置于-20℃保存备用。

1.3.4Real-timePCR 引物（miR-155，内参U6）由美国Invitrogen公司合成。PCR反应体系（总体积20 μL）：SYBRGreenmix10μL，特异性引物2μL，通用引物2μL，cDNA2μL，ddH2O4μL。反应条件95℃预变性10min；95℃ 10s，60℃ 1min，共40个循环。每个标本均做3个复孔，反应结束后作溶解曲线分析。RT-PCR检测结果采用2-ΔCt法分析，选择U6基因表达量值作为内参照。将同一样本目的基因的Ct值分别减去其相应的U6的Ct值，获得ΔCt值，最后计算目的基因相对表达量2-ΔCt。

1.3.5取上述外周血另一管标本，使用IL-5、IFN-γ ELISAkit，按照说明书进行操作，读取血清样本的吸光度值（A），通过标准曲线计算样本浓度值。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0软件包进行统计分析，miR-155相对表达量用¯x±s表示。独立样本比较采用单因素方差分析；相关性分析，双变量正态分布资料计算Pearson相关系数，不符合双变量正态分布资料，计算Spearman相关系数。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1AD患者与健康对照组的相关数据情况 45例AD患儿，其中男23例，女22例，年龄6.3～12.0岁，平均8.8±3.2岁。根据SCORAD评分，将其分为轻、中、重度3组（＜15分为轻度，15～40分为中度，＞40分为重度）。对照组38例，其中男21例，女17例，年龄6.0～12.0岁，平均9.0±1.8岁，对照组和AD患儿组性别、年龄差异无统计学意义。AD组血清IL-5的量高于对照组，而IFN-γ的表达低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。AD患者组miR-155在CD4+T细胞中的表达均高于健康对照组（P＜0.05），且AD患者中、重度组miR-155的表达水平均高于轻度组（P＜0.05）；中度组与高度组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2AD患儿CD4+T细胞miR-155的表达水平与血清IL-5、IFN-γ表达水平、皮炎严重程度SCORAD评分相关性分析 AD组患者体内CD4+T细胞miR-155的表达水平与皮炎严重程度SCORAD评分呈正相关（r=0.529，P＜0.05），与血清IL-5的表达水平呈正相关（r=0.459，P＜0.05），与血清中IFN-γ表达水平呈负相关（r=-0.310，P＜0.05），见图1。

表1　对照组和AD轻、中、重度组miR-155、IL-5、IFN-γ的表达

图1　AD患者CD4+T细胞miR-155的表达与SCORAD、血清IL-5、IFN-γ表达相关性分析

3　讨论

近年来研究显示在异常免疫反应中miR-155高表达。在一些自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）、多发性硬化（MS）中miR-155表达异常，一些过敏性疾病如过敏性哮喘患者中也能发现 miR-155的表达异常。6自 2007年Sonkoly等发现miRNA在银屑病、AD皮损中异常表达以来，miRNA在皮肤病方面的研究越来越多。4研究发现miRNA-155在AD皮损浸润的淋巴细胞中呈特异性高表达，主要是CD4+T细胞高表达。伴随着T细胞分化、活化miRNA-155的表达显著升高。上调表达的miRNA-155通过结合细胞毒T细胞相关抗原4（cytotoxicTlymphocyte-associatedantigen-4，CTLA-4）的3'非编码区（3'-UTR）而抑制CTLA-4，从而发挥调节T细胞功能。7

本课题组通过检测45例6岁以上AD患儿外周血CD4+T细胞miR-155的表达变化，发现与健康对照组相比，不同严重程度的AD患者外周血CD4+T细胞miR-155的表达有不同程度的升高，与Sonkoly等7的发现一致。同时我们还发现miR-155的表达水平与皮损严重程度评分（SCORAD）呈正相关。Th细胞亚群的失衡在AD的发生发展中有着重要的作用，目前认为Th2介导的迟发型超敏反应是AD的主要发病机制。关于miR-155在Th分化中的研究是近几年的热点之一，8我们分别检测AD患儿Th1、Th2的标志性细胞因子IFN-γ和IL-5，发现AD患者以Th2细胞占优势，这与传统观点一致。既往体外研究显示miR-155以IFN-γ受体为靶点抑制IFN-γ反应，从而使CD4+细胞向Th1分化。9我们进一步将miR-155的表达与IL-5、IFN-γ进行相关性分析发现，miR-155的表达与IL-5的量呈正相关，而与IFN-γ呈负相关。我们推测AD患者体内Th1/Th2的状态存在动态变化。

综上所述，我们发现特应性皮炎患儿外周血CD4+T细胞miR-155的表达升高，且随皮损严重程度加重，表达量增高。miR-155可以作为评定AD严重程度的一个指标。

1CarmiLI，HomeyB，SoumelisV.Amodularviewofcytokine networksinatopicdermatitis.ClinRevAllergyImmunol，2011，41（3）：245-253.

2HaTY.TheroleofmicroRNAsinregulatoryTcellsandtheimmuneresponse.ImmuneNetwork，2011，11：11-41.

3文韵诗，秦海红，徐金华.系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞中miR-17和miR-20a的表达及与病情活动的相关性研究.中华皮肤科杂志，2014，47（3）：172-175.

4SonkolyE，WeiT，JamonPC，etal.MicroRNAs：Novelregulatorsinvolvedinthepathogenesisofpsoriasis？PLoSOne，2007，2（7）：e610.

5KunzB，OranjeAP，LabrèzeL，etal.Clinicalvalidationand guidelinesfortheSCORADindex：consensusreportoftheeuropeantaskforceonatopicdermatitis.Dermatology，1997，195（1）：10-19.

6VigoritoE，KohlhaasS，LuD，etal.MiR-155：anancientregulatoroftheimmunesystem.ImmunolRev，2013，253（1）：146-157.

7SonkolyE，JansonP，MajuriML，etal.MiR-155isoverexpressedinpatientswithatopicdermatitisandmodulatesT-cell proliferativeresponsesbytargetingcytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4.JAllergyClinImmunol，2010，126（3）：581-589.

8JiaS，ZhaiH，ZhaoM.MicroRNAsregulateimmunesystemvia multipletargets.DiscovMed，2014，18（100）：237-247.

9ArnobB，FelixS，CaitlinS，etal.Micro-RNA-155inhibits IFN-γsignalinginCD4+Tcells.EurJImmunol，2010，40（1）：225-231.

（收稿：2015-04-29 修回：2015-07-22）

Correlation ofm iR-155 in peripheralblood CD4+T cells from children with atopic dermatitiswith disease severity

CHEN Shi-sheng，YU Su-ting，ZHOU Peng-fei，et al.Department ofDermatology，Second Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Zhejiang，Wenzhou，325000

Objective：To determ ine the correlation ofmiR-155 in the peripheral blood CD4+T cells from children with atopic dermatitis（AD）with disease severity.M ethods：The expression levels ofmiR-155 of 45 children with AD and 38 healthy controlswere detected by Real time-PCR.The levels of serum IL-5 and IFN -γwere tested by ELISA.SCORAD of the patientswere assessed.Resu lts：The expression level ofmiR-155 of children with AD was higher than that in healthy controls（P＜0.05）.The expression level ofmiR-155 was positively correlated with the SCORAD and serum IL-5 level（P＜0.05）and negatively correlated with serum IFN-γ（P＜0.05）.Conclusion：miR-155 is positively correlated with the disease severity in children with AD，which can be used for amarker of disease severity in AD.

children；atopic dermatitis；miR-155

温州医科大学附属第二医院，浙江温州，325000