葡萄多酚对果蝇寿命影响和小鼠体内脂质过氧化的研究

张爱军 臧家业

（国家海洋局第一海洋研究所，山东青岛 266061）

葡萄多酚对果蝇寿命影响和小鼠体内脂质过氧化的研究

张爱军 臧家业

（国家海洋局第一海洋研究所，山东青岛 266061）

目的，研究葡萄多酚对果蝇寿命的影响以及降低小鼠体内脂质过氧化的作用。方法 用葡萄多酚样品喂食果蝇，以高、中、低三种剂量的原花青素喂食小鼠45d，对照组给予等体积的蒸馏水，测定各项指标。结果，果蝇生存试验阳性。0.015%和0.045%的原花青素对雄性和雌性果蝇的最高寿命和平均寿命与对照比较均有显著延长作用（P＜0.01）。0.002%和0.005%的原花青素剂量组与对照组比较最高寿命和平均寿命均无显著差别（P＞0.05）。对小鼠的实验结果表明，高剂量组与老龄对照组比较， MDA含量明显降低，血清SOD活力明显升高（P＜0.05）。结论，表明该物质对果蝇的最高寿命和平均寿命都有明显延长作用，对小鼠具有降低脂质过氧化作用。

葡萄多酚 果蝇 寿命 脂质 过氧化作用

葡萄多酚（Grape Proanthocyanidins， GPC）是从葡萄籽中提取的多酚类化合物［1］。主要含低聚原花青素（O l i g o m e r i c Proanthocyanidins），原花青素拥有强有力的抗氧化能力，在体内其抗氧化、清除自由基能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍［2］。国外关于原花青素的功能研究较多，在日本厚生省已于1996年批准把葡萄多酚列入《天然食品剂名单中》［3，4］。近几年，国内葡萄多酚的研究也逐步热起来，将葡萄多酚开发成为保健品或药品，必需进行相关的生物安全性分析评价。因此，本文开展了葡萄多酚毒理学研究，为葡萄多酚开发应用保健品或药品提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

（1）样品，红棕色粉剂（水分4.4%，灰分1.3%，原花青素93.62 %），青岛海隆达生化科技有限公司。原花青素标准品，sigma公司提供。（2）试验动物，黑腹果蝇，OreganK品系，山东师范大学生物系；健康二级昆明种雄性15月龄老龄鼠和8周少龄小鼠，山东大学实验动物中心。（3）剂量选择，以果蝇为研究动物的剂量选择：设1个空白对照组和4个剂量组，各剂量组含原花青素分别为0.002%、0.005%、0.015 %、0.045%。以小鼠为试验动物的剂量选择：原花青素成人推荐量为120mg/kg·b.w（成年人体重按60kg计算）。分别扩大3、10和30倍作为低（360 mg/kg·b.w）、中（1200 mg/kg·b.w）和高剂量（3600 mg/ kg·b.w）老龄鼠实验组，另设老龄对照组和少龄对照组，每组动物10只。用蒸馏水将样品配制所需浓度，连续经口灌胃45d，对照组给予等体积的蒸馏水，测定各项指标。（4）主要仪器和试剂，生化培养箱（25±0.5℃，湿度60%～65%）、培养指管、乙醚、丙酸；960-荧光分光光度计、722分光光度计、离心机、混旋器、微量加样器、恒温水浴锅；6.7g/L硫代巴比妥酸TBA－冰醋酸（1：1）混合液、10nmol/ml四乙氧基丙烷、100g/L磷钨酸、10mmol/L盐酸羟胺、7.5mmol/L黄嘌呤、0.023u/ml黄嘌呤氧化酶、10g/L甲萘胺、3.3g/L对氨基苯磺酸、3g/L磺基水杨酸、SOD标准品等。

表1　原花青素对果蝇生存时间的影响

1.2实验方法

1.2.1葡萄多酚对果蝇寿命影响的研究方法

（1）果蝇饲料配制，用玉米粉、白糖、琼脂、丙酸、干酵母粉分别以8.5%、6.5%、1.0%、0.5%、0.75%的比例用蒸馏水配制成基础饲料。按剂量分组要求，称取原花青素加入到溶化的基础饲料中，充分调匀，配制成试验饲料。调pH值使各组一致。（2）扩增果蝇，在装有基础饲料的指管中放入雌雄各半20只果蝇，25℃恒温箱内饲养。（3）分组试验，从上述指管中每日定时挑选8h内孵出的成虫，乙醚麻醉后称体重，分组，每管20只，雌雄分养，每组雌雄各200只。在成虫期空白对照组给予基础饲料，试验组给予含不同剂量受试物的试验饲料。每天定时统计果蝇存活数、死亡数，直到全部死亡。每组最后死亡的20只果蝇成虫存活天数的平均数，为该组的最高寿命。每组全部果蝇成虫存活天数的平均数，为该组的平均寿命。试验结束，计算平均寿命，最高寿命及半数死亡时间。

1.2.2葡萄多酚小鼠体内脂质过氧化的研究方法

（1）全血中过氧化脂质降解物丙二醛（MDA）含量测定。

样品制备：取全血50ul加入1ml生理盐水，2000r/min离心10min，取上清液待测。

标准曲线制作：将10nmol/ml四乙氧基丙烷，用蒸馏水稀释成0.25、0.5、1、1.5、2和5nmol/ml，分别取1ml加入TBA－冰醋酸（1：1）混合液1ml，混匀，沸水浴75min，流水冷却至室温，加5ml正丁醇振荡提取2min，3000r/min离心10min，取上清液（正丁醇层）用荧光光度计测荧光强度（狭缝10nm，激发光波厂515nm，发射光波长553nm）。

全血样品测定：全血样品上清液0.5ml，加入1/6mol/L硫酸4ml、100g/L磷钨酸0.5ml摇匀，室温放置5min，3000r/min离心10min，弃上清液，沉淀加1/6mol/L硫酸2ml、100g/L磷钨酸0.3ml摇匀，室温放置5min， 3000r/min离心10min，弃上清液，沉淀加1ml蒸馏水振摇2min，以下操作步骤同标准曲线，同时以浓度0.5 nmol/ ml的四乙氧基丙烷为标准对照。

全血MDA含量计算：MDA含量（nmol/ml）=0.5×f/F×1/ 0.05×1.05/0.5

式中F：0.5nmol/ml四乙氧基丙烷荧光强度；

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f：样品荧光强度。

（2）血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力测定（羟胺法）。

血清样品制备：取全血50ul，制备血清待测。

血清中SOD活力测定：依次取1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.8）1.0ml，血清样品20ul，10mmol/L盐酸羟胺0.1ml，7.5mmol/L黄嘌呤0.1ml，0.023u/ml黄嘌呤氧化酶0.1ml，双蒸水0.5ml加入到试管内混匀，37℃恒温水浴30min，再加入3.3g/L对氨基磺酸2.0ml，10g/L甲萘胺2.0ml，混匀，常温放置15min，倒入1cm光径比色杯，以蒸馏水调零，530nm处比色测定OD值，同时进行空白对照测定。

SOD活力的计算：按以下公式计算SOD百分抑制率：SOD百分抑制率=（对照管OD－测定管OD）/对照管OD×100%按每ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个单位，按以下公式计算SOD的活力：

SOD活力（u/ml）=SOD百分抑制率/50%×样品稀释倍数（3）统计处理：采用方差分析进行数据处理。

2　结果

2.1原花青素对果蝇寿命影响的结果

2.2原花青素对小鼠全血中过氧化脂质降解物丙二醛（MDA）含量的影响

表1显示，经口给予老龄小鼠原花青素45d，老龄对照组MDA236.5 ±38.9nmol/ml，少龄对照组MDA167.6±37.4nmol/ml，低剂量组MDA233.9±33.4nmol/ml，中剂量组MDA223.4±42.8nmol/ml，高剂量组MDA189.0±37.4*nmol/ml。（注：* P＜0.05，高剂量实验组与老龄对照组比较）

高剂量组与老龄对照组比较，全血MDA含量明显降低（P＜0.05），低剂量组和中剂量与老龄对照组比较，全血MDA含量差异无显著性。

注：* P＜0.05，高剂量实验组与老龄对照组比较

2.3原花青素对老龄小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力的影响

结果显示，老龄对照组SOD208.1±8.2u/ml，少龄对照组279.2±14.9u/ml，低剂量组215.4±11.2u/ml，中剂量组225.1 ±18.0u/ml，高剂量组247.6±22.6*u/m。（注：* P＜0.05，高剂量实验组与老龄对照组比较）

实验结果表明，经口给予老龄小鼠原花青素45d，高剂量组与老龄对照组比较，血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力明显增高（P＜0.05），低剂量组和中剂量与老龄对照组比较，血清中SOD活力差异无显著性。

3　结语

（1）用不同浓度的原花青素饲喂黑腹果蝇，研究原花青素对果蝇寿命的影响。结果表明，0.015%和0.045%的剂量组和对照组比较，果蝇的最高寿命和平均寿命都有明显延长，生存试验阳性。然而，0.002 %和0.005%的原花青素剂量组与对照组比较最高寿命和平均寿命均无显著差别，说明该物质只有达到一定含量才能起到延长寿命的作用。

（2）经口给予小鼠原花青素45天，高剂量组与老龄对照组比较，MDA含量明显降低，血清SOD活力明显升高，实验结果表明，原花青素有降低脂质过氧化作用。

（3）原花青素之所以能够延长寿命，可能与其拥有强有力的抗氧化能力有关［5］。研究表明，原花青素在体内其抗氧化、清除自由基能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍［6］。原花青素制品在欧美等西方国家市场非常走俏，一瓶60粒胶囊（每粒含原花青素50毫克）售价为23.95美元，而每粒含100毫克的原花青素一瓶售价为39.95美元，原花青素在保健品中市场零售价高达4.48万元/千克。我国目前未有以原花青素为主要有效成份的药品、保健品的开发才刚刚开始，目前的用量很少。但由于其明显的生物活性效应和使用效果，必将在食品添加剂，保健品，化妆品，药品等方面得到广泛的应用，需求逐渐增加，具有相当强劲的市场前景和经济效益。

［1］王传现，钟进义.葡多酚对活性氧自由基的清除作用研究.营养学报，2001，23（2）：170-173.

［2］钟进义，栗世如.葡多酚对小鼠DNA与染色体放射性损伤的防护作用［J］.中华劳动卫生职业病杂志，1999，17：211-213.

［3］ Ricardo-Da-Silva LM， Rigaud J， Cheynier V， et al. Procyanidin dimmers and trimers from grape seeds［J］. Phytochemistry，1991，30（4）：1259-1264.

［4］Kanner J， Frankel E， Granio R， et al. Natural antioxidants in grapes and wines ［J］. J Agric FoodChem， 1994，42：64-68.

［5］王传现，钟进义.葡多酚对活性氧自由基的清除作用研究.营养学报，2001，23（2）：170-173.

［6］中国制药信息.1998，4.