厄贝沙坦抑制大鼠平滑肌细胞AT1R及其下游信号通路

龚晶婧 卢卓强 许昌声 王华军 晋学庆*

（福建医科大学附属第一医院，福建 福州 350005）

厄贝沙坦抑制大鼠平滑肌细胞AT1R及其下游信号通路

龚晶婧 卢卓强 许昌声 王华军 晋学庆*

（福建医科大学附属第一医院，福建 福州 350005）

目的 本研究目的是利用厄贝沙坦、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）干预平滑肌细胞，阐明血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂（ARB）对血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）表达及其下游信号通路的影响。方法 利用Western Blot技术，研究厄贝沙坦、血管紧张素Ⅱ干预平滑肌细胞后对细胞AT1受体蛋白表达及其下游信号通路-细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和信号转导子和转录激活子3（STAT3）蛋白磷酸化水平的影响。结果 研究发现厄贝沙坦能显著地抑制AngⅡ诱导的AT1受体蛋白表达（ 0.208±0.022 vs 0.997±0.131，P<0.01）及下游信号通路中的ERK1/2蛋白磷酸化（0.055±0.007 vs 0.103±0.020，P<0.01）、STAT3蛋白磷酸化（0.162±0.010 vs 0.758±0.054，P<0.01）。结论 这些研究结果表明厄贝沙坦抑制AT1R和下游的ERK1/2及STAT3信号通路，从而抑制AngⅡ诱导的平滑肌细胞增殖等，发挥控制血压、防治心脑血管疾病作用。

厄贝沙坦；血管紧张素Ⅱ1型受体；ERK1/2；STAT3

肾素-血管紧张素系统（RAS）在人体内涉及多器官、多系统，是一种重要的调节系统和循环通路。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是RAS系统中一个重要的负性调控物质，是由一种重要代谢酶即血管紧张素转化酶（ACE）转换血管紧张素1产生的。AngⅡ作用于AT1受体，主要的生理作用是引起血管平滑肌细胞增生、迁移和细胞肥大、血管收缩、内皮损伤、组织重构、炎性因子表达和促进氧化应激等生物学效应[1-2]。目前血管紧张素Ⅱ受体特异性抑制剂（ARB）主要作用于肾素-血管紧张素- 醛固酮系统，能有效地控制血压，改善心功能，提高患者的运动耐受时间并显著改善症状等，在临床上已成为治疗高血压及心血管疾病，减少心脑血管事件及肾功能障碍发生的一线药物之一[3]。

对AT1 R研究已经证明，血管紧张素Ⅱ的生物作用，大部分是通过与AT1R结合后实现的[4-5]。AT1受体调控主要是通过细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、p38-丝裂原活化蛋白激酶（p38- MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、信号转导及转录激活因子3（STAT3）等来调节平滑肌细胞的增生、迁移、黏附等。

本研究主要通过血管紧张素Ⅱ受体特异性抑制剂（ARB）类药物厄贝沙坦干预平滑肌细胞，研究厄贝沙坦对AngⅡ诱导的AT1受体蛋白及下游信号通路中的ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平的影响，探讨ARB类药物拮抗AngⅡ的生物学作用，从而进一步研究其防治心脑血管疾病的机制。

1　材料与方法

1.1主要材料：体质量为120～130 g普通SD成年大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，AngⅡ购自Sigma公司（美国），厄贝沙坦：扬子江药业惠赠，TRIZOL试剂：购自Invitrogen公司（美国），兔抗大鼠AT1R一抗（英国Abcam公司），兔抗大鼠P-STAT3、STAT3一抗（美国CST公司），兔抗大鼠P-ERK1/2、ERK1/2一抗（美国CST公司），小鼠β-actin一抗、羊抗大鼠和小鼠二抗（美国Santa Cruz公司），DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）。

1.2SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞（VSMC）的培养。SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞（VSMC）的培养：采用组织贴块法培养。

1.3实验分组：对照组仅用DMEM（2000 mg/L D-葡萄糖、非必需氨基酸、110 mg/L丙酮酸钠、1.5 g/L碳酸氢钠、25 mmol/L HEPES和L-谷氨酰胺培养基，pH 7.4）；AngⅡ干预组的终浓度分别为10-7mol/L，各组干预VSMC细胞8 h。厄贝沙坦干预浓度为10-7mol/L，在Ang Ⅱ干预前0.5 h 加入。细胞分组：①空白对照组。②AngⅡ组。③AngⅡ+厄贝沙坦组。④厄贝沙坦组。

1.4Western Blot检测AT1R蛋白表达和ERK1/2及STAT3蛋白磷酸化水平：将细胞接种在6孔培养板上，分别将Ang Ⅱ和厄贝沙坦按上述最适浓度干预VSMCs完成后，在每孔中加入200 μL RIPA（组成：50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS），提取蛋白。10%的SDS-PAGE电泳、转膜，5% 的脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入兔抗大鼠AT1R（1∶800），兔抗大鼠P-ERK1/2、ERK1/2（1∶800），兔抗大鼠P-STAT3、STAT3（1∶800），4 ℃ 过夜，用TBST（组成：1M Tris-HCl 10 mL pH 7.4，NaCl 8.8 g，吐温200.05%）洗3次，每次10 min。加入二抗（1∶1500），室温培育1 h，TBST洗3次，每次10 min。显色、曝光，经Guantity onel软件分析A值，并与内参照的比值作为半定量指标进行比较。

1.5统计学处理：每个样本采用复孔，重复4次。所得数据均采用SPSS16.0软件系统分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间指标的均数比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两均数比较采用LSD检验。P<0.05被认为有显著性差异。

2　实验结果

2.1厄贝沙坦对AngⅡ诱导VSMC 后AT1受体蛋白表达水平的影响：Western-Blot检测VSMC中AT1受体蛋白的表达。我们观察到：与空白对照组相比，AngⅡ干预VSMC后AT1受体蛋白的表达明显增加（0.731±0.079 vs 0.997±0.131，P<0.01）。厄贝沙坦干预VSMC后能抑制AngⅡ诱导的AT1受体蛋白的表达，较AngⅡ组明显减少（0.208±0.022 vs 0.997±0.131，P<0.01）。另外厄贝沙坦组的AT1受体蛋白表达水平同样较空白组减少（0.093±0.011 vs 0.731±0.079，P<0.01）。上述结果说明厄贝沙坦干预平滑肌细胞后明显抑制Ang Ⅱ对AT1受体的刺激作用。见图1。

图1　显示Western blot检测不同干预组平滑肌细胞AT1R蛋白表达，结果表明：AngⅡ增加AT1受体蛋白的表达，与对照组相比P<0.01。厄贝沙坦干预能明显减少AngⅡ 诱导的VSMC AT1受体蛋白的表达，与Ang Ⅱ 组对比P<0.01（n=4）（*P<0.01 vs 空白对照组 ，# P<0.01，vs AngⅡ组 a：空白对照；b：AngⅡ；c：AngⅡ+厄贝沙坦；d：厄贝沙坦AnⅡ：血管紧张素Ⅱ ； AT1R：血管紧张素Ⅱ 1型受体

2.2厄贝沙坦对AngⅡ诱导VSMC后ERK1/2蛋白磷酸化水平的影响：Western-Blot检测VSMC中STAT3蛋白磷酸化水平。我们观察到：与空白对照组相比，AngⅡ干预VSMC后STAT3蛋白磷酸化水平明显增加（0.062±0.008 vs 0.103±0.020，P<0.01）。厄贝沙坦干预VSMC后明显抑制AngⅡ诱导的ERK1/2蛋白磷酸化，较AngⅡ组明显减少（0.055 ±0.007 vs 0.103±0.020，P<0.01）。另外厄贝沙坦组的ERK1/2蛋白磷酸化水平同样较空白组减少（0.026±0.006 vs 0.062±0.008，P<0.01）。以上结果表明厄贝沙坦明显抑制Ang Ⅱ 刺激AT1受体介导的信号通路ERK1/2的磷酸化。见图2。

2.3厄贝沙坦对AngⅡ诱导VSMC后STAT3蛋白磷酸化水平的影响：Western-Blot检测VSMC中STAT3蛋白磷酸化水平。我们观察到：与空白对照组相比，AngⅡ干预VSMC后STAT3蛋白磷酸化水平明显增加（0.318±0.059 vs 0.758±0.054，P<0.01）。厄贝沙坦干预VSMC后明显抑制AngⅡ诱导的STAT3蛋白磷酸化，较AngⅡ组明显减少（0.162±0.010 vs 0.758±0.054，P<0.01）。另外厄贝沙坦组的STAT3蛋白磷酸化水平同样较空白组减少（0.081±0.031 vs 0.318±0.059，P<0.01）。以上结果表明厄贝沙坦明显抑制AngⅡ 刺激AT1受体介导的信号通路STAT3的磷酸化。见图3。

图2　显示Western blot检测不同干预组平滑肌细胞ERK1/2蛋白磷酸化水平，结果表明：AngⅡ增加ERK1/2蛋白的磷酸化，与对照组相比P<0.05。厄贝沙坦干预后能明显减少Ang Ⅱ 诱导的ERK1/2蛋白的磷酸化，与AngⅡ 组对比P<0.01（n=4）（* P<0.01vs空白对照组，# P<0.01vs AngⅡ组a：空白对照；b：AngⅡ；c：AngⅡ+厄贝沙坦；d：厄贝沙坦 ERK1/2：细胞外信号调节激酶1/2；T：total；P：phosphorylation

图3　显示Western blot检测不同干预组平滑肌细胞STAT3蛋白磷酸化水平，结果表明：AngⅡ增加STAT3蛋白的磷酸化，与对照组相比P<0.05。厄贝沙坦干预后能明显减少AngⅡ诱导的STAT3蛋白的磷酸化，与Ang Ⅱ 组对比P<0.01（n=4）（* P<0.01vs空白对照组，# P<0.01 vs AngⅡ组 a：空白对照；b：AngⅡ；c：AngⅡ+厄贝沙坦；d：厄贝沙坦 STAT3：信号转导子和转录激活子3；T：total；P：phosphorylation

3　讨 论

本研究发现，AngⅡ能诱导平滑肌细胞的AT1受体蛋白表达和AT1下游信号通路ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平，而ARB类药物厄贝沙坦干预平滑肌细胞后，能明显地抑制AngⅡ诱导的AT1受体蛋白表达和ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平，差异有显著统计学意义。

AngⅡ的生物作用，主要是通过与AngⅡ特异性1型受体（AT1R）结合后实现的[5-9]。大量研究表明AT1受体调控主要是通过ERK1/2、p38、JNK来调节平滑肌细胞的增殖、黏附。近年来也有少量报道表明，JAK2、IRS-1的磷酸化也参与AT1受体调节细胞的增殖、黏附[10-11]。ARB类药物可在受体水平上高选择、高效地阻断AngⅡ与AT1 受体的结合，导致血管平滑肌收缩、醛固酮分泌增加，能有效地阻断AngⅡ的水钠潴留、血管收缩与组织重构作用，从而阻断AngⅡ介导的生物学效应。何松坚等通过检测2 型糖尿病大鼠血清AT1受体自身抗体证明厄贝沙坦联合缺血后适应可明显减轻2 型糖尿病大鼠缺血再灌注后AT1R的表达，从而可能抑制早期心肌及间质纤维化的发生，抑制早ARB类药物具有控制血压、减轻心肌肥厚、改善早期心肌纤维化、减轻早期心室重构、改善预后的作用。其机制可能与调节AngⅡ、AT1R 的水平有关。本研究发现，厄贝沙坦能明显地抑制AngⅡ诱导的AT1R 蛋白水平以及AT1下游信号通路上的ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平。目前国内外也有类似的研究报道。Moreno 等研究发现，AT1受体阻滞剂厄贝沙坦能够通过抑制异源表达的KCNQ1/ KCNE1 通道电流[14]，阻滞AT1受体产生，起到治疗房颤作用，提示ARB类药物治疗房颤的机制不但涉及心脏组织再建，同时也影响心脏电生理再建。周希等研究发现替米沙坦通过AT1R经ERK 信号途径影响高血压大鼠纤溶系统的活性[15]。Benkirane等研究证实替米沙坦可以抑制AngⅡ经AT1R 介导的ERK 信号通路激活，从而抑制AngⅡ诱导的平滑肌细胞的增殖和物质合成[16]。另外，替米沙坦亦可通过AT1R 作用经ERK 信号通路调控纤溶活性从而改善大鼠心肌梗死后的纤溶系统功能[17]。

期心室重构[12]。王亚萍等研究发现替米沙坦可通过减少肾周脂肪堆积，抑制其局部RAAS，改善肥胖相关的血压异常[13]。

综上所述，ARB类药物厄贝沙坦能通过下调AngⅡ诱导的AT1受体蛋白及下游信号通路中的ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化从而拮抗AngⅡ诱导的生物学作用，减轻细胞炎症及增殖等，最终抑制血管收缩、血压升高、心肌重构、血管斑块不稳定方面等病理改变，发挥预防及治疗心脑血管疾病的生理作用。

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Irbesartan Inhibits the AT1 Receptor -ERK1/2 and STAT3 Signal Pathway in Smooth Muscle Cells

GONG Jing-jing, LU Zhou-qiang, XU Chang-sheng, WANG Hua-jun, JIN Xue-qing
（The First Affiliated Hospital， Fujian Medical University， Fuzhou 350005， China）

Objective To explore the effects of the angiotensintype1-receptor blockers (ARB) on the expression of angiotnsin Ⅱ type 1 receptor. Methods Irbesartan was added into cultured vascular smooth muscle cells (VSMCs). Angiotensin Ⅱ type 1 (AT1) recetpor protein expression were detected with western blot, at the same time, the signalling pathway of (extracellular signal-regulated kinase 1/2)ERK1/2 and (Signal Transducer and Activator of Transcription 3) STAT3 AT1 receptor actived were also detected. Results It was found that Irbesartan inhibit significantly AT1 receptor protein expression，not only in the absence , but also in the presence of AngⅡ. Similar to AT1 receptor protein expression, the signal ERK1/2 and STAT3 phosphorylation was obviously inhibited while Irbesartan intervention. Conclusion This study data show that Irbesartan was able to inhibit AT1 receptor expression and signal pathway of ERK1/2 and STAT3 phosphorylation.

Irbesartan; AT1R; ERK1/2; STAT3

R54

B

1671-8194（2015）30-0028-03