荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品的制备

赫玉芳赵昱玮方向明吕 娜南敏伦* 焦连庆

（1 吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012；2 长春理工大学，吉林 长春 130022；3 吉林农业大学，吉林 长春 130118）

荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品的制备

赫玉芳1赵昱玮1方向明2吕 娜3南敏伦1* 焦连庆1

（1 吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012；2 长春理工大学，吉林 长春 130022；3 吉林农业大学，吉林 长春 130118）

目的 制备一种用于金莲花及金莲花制剂含量测定的对照品。方法 通过柱层析、重结晶方法进行分离、纯化制备荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品，采用薄层色谱法、HPLC归一化法测定其纯度；利用理化性质、波谱特征鉴定其结构。结果 从金莲花的乙醇提取液中分离得到纯度>98%的荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷。结论 荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷可以作为金莲花及金莲花制剂含量测定用对照品。

金莲花；荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷；对照品；制备

金莲花为毛茛科金莲花属植物金莲花（Trollius chinensis Bunge.）的花，为常用中药，具有清热解毒的作用，主要用于咽炎，扁桃体炎，急性中耳炎、急性淋巴管炎的治疗[1]。金莲花主要含有碳苷黄酮类化合物，以荭草苷和荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷为主，也是主要的抗菌消炎成分[2-3]。目前金莲花药材制成的单味制剂较多，包括片剂、胶囊、颗粒、口服液，但是，金莲花药材及制剂的质量主要以芦丁为对照品，测定总黄酮的含量[4]，缺乏有效的特征成分定量的质量控制手段。本文首次对主要化学成分荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷进行对照品研究，为了进一步控制金莲花药材及制剂的质量具有直接意义。

本实验采用大孔树脂分离得到总黄酮，利用荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的性质，利用聚酰胺树脂吸附极性小的黄酮，未吸附部分主要为荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，与以往分离黄酮类化合物具有明显不同，也为以后分离黄酮苷类化合物提供参考。本实验主要采用常压ODS反相硅胶柱纯化荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，可以大量制备，具有快速、简便、纯化效果好的特点，具有工业化生产应用价值，也为荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷分离纯化提供一种新思路。

1　仪器与材料

LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津）；BRUKER AV-400型核磁共振波谱仪Finnigan LCQTM离子阱质谱仪；BS 120S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。M-X-4显微熔点测定仪（克勒格瓦尼分析仪器有限公司）；RE52-98旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；AB-8大孔吸附树脂（天津波鸿树脂科技有限公司）；聚酰胺吸附树脂（天津津立龙精细化工有限公司）；ODS（北京京京时代科技发展有限公司）；硅胶G高效薄层板（青岛海洋化工厂）；乙腈（美国Fisher）；其他实际均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

金莲花为内蒙古阿尔山所产，由吉林省中医药科学院赵全成教授鉴定为毛茛科植物金莲花（Trollius chinensis Bunge.）的花。

2　试验方法与结果

2.1提取分离与分离：取金莲花药材4 kg，加8倍量55%乙醇提取3次，每次2 h，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩至浸膏，得乙醇提取浸膏0.85 kg。取乙醇提取浸膏，加去离子水至8000 mL，置AB-8大孔吸附树脂（内经10 cm×柱高80 cm）上，先用去离子水洗脱至无色，再用55%乙醇洗脱4倍柱体积（约5000 mL×4），收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，减压干燥，得金莲花总黄酮268 g。

将金莲花总黄酮用3000 mL去离子水溶解，置聚酰胺吸附树脂柱（内经10 cm×柱高80 cm）上，用去离子水洗脱3倍柱体积，收集流出液及水洗脱液，浓缩，干燥，得到荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷粗品126 g。

取荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷粗品500 mg，用甲醇溶解，置常压ODS柱（内经4 cm ×柱高60 cm），以乙腈-体积分数为0.35%磷酸溶液（15∶85）为洗脱剂，共得到62个流份，合并23～40流份，用1 mol/L碳酸钠溶液调调pH为6，减压蒸除乙腈后，利用乙酸乙酯振摇提取3次，每次250 mL，合并乙酸乙酯液，加入适量无水硫酸钠，搅拌，放置，滤过，滤液回收溶剂，重结晶，得到荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷285 mg。

2.2理化性质及结构鉴定：此化合物为黄色针状结晶（甲醇），mp 218～220 ℃，盐酸-镁粉反应呈阳性，可溶于DMSO、甲醇等溶剂。ESI-MS m/z：608.9[M-H]-。1H-NMR，13C-NMR见表1，数据与文献文献[5]报道荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的数据基本一致，可确定化合物为荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷（2"-O-β-L-galactopyranosylorientin）。结构式见图1。

表1　荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷在DMSO-d6的1H和13C-NMR数据

图1　荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷结构式

2.3纯度检测

2.3.1薄层色谱法：取荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷适量，加甲醇制成1 mg/mL的溶液。吸取上述溶液各5、10、15 μL点于同一硅胶G高效薄层板上，分别用：①乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶0.3）；②氯仿-甲醇-甲酸（8∶2∶0.5）；③乙酸乙酯-甲酸-水（10∶0.5∶0.5）三个展开系统展开，取出，展开剂挥干后，喷以2%三氯化铁乙醇溶液，热风吹至斑点清晰，可见荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷相同颜色的斑点，色谱中不显杂质斑点。

2.3.2高效液相色谱法：取荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成0.2 mg/mL的溶液。液相色谱条件：ACE C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相：乙腈-体积分数为0.4%磷酸溶液（15:85）[2]，检测波长：340 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：室温，进样量：10 μL，采集时间为30 min，面积归一法计算荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷质量分数为99.35%。

2.4稳定性：将荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品于室温条件下放置18个月，进行长期稳定性考察。按“2.3.2”方法进行检测，测定其峰面积值，面积归一化法计算其质量分数，实验结果表明，荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品在室温条件下18个月内稳定。实验结果见表2。

表2　荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品稳定性试验结果

3　讨 论

金莲花中荭草苷及荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷含量均在2.0%左右，有些产地含量可以达到3.5%，是主要的特征和有效成分[2]，但是，荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷没有法定的对照品。本实验采用大孔树脂分离得到总黄酮，利用荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷的性质，以聚酰胺树脂吸附极性小的黄酮，未吸附部分主要为荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，与以往分离黄酮类化合物具有明显不同，也为以后分离黄酮苷类化合物提供参考。

本实验主要采用常压ODS反相硅胶柱纯化荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，可以大量制备，具有快速、简便、纯化效果好的特点，具有工业化生产应用价值，也为荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷分离纯化提供一种新思路。同时，本实验制备荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷对照品符合中药化学对照品的要求，可作为金莲花药材和含金莲花成药质量控制，以及中药药效物质基础研究用的化学对照品。

[1] 江苏新医学院编.中药大辞典(上册)[M].上海:上海人民出版社, 1977:1398-1399.

[2] 赫玉芳,南敏伦,赵昱玮,等. RP-HPLC 法同时测定金莲花中3种碳苷黄酮的含量[J].沈阳药科大学学报,2013,30(3):197-200.

[3] 王凌云,周艳辉,李药兰,等.长瓣金莲花中黄酮苷的抑菌活性研究及牡荆苷的含量测定[J].中药新药与临床药理,2003,14(4):252-253.

[4] 谭晓红,方秀梅.金莲花中总黄酮含量的测定[J].张家口医学院学报,2002,19(6):37-38.

[5] 董永喜,张桂青,王爱民,等.金莲花水溶性化学成分的研究[J].中国药业,2012,21(19):17-18.

R282.710.3

B

1671-8194（2015）32-0032-02

吉林省科技发展计划重点项目（20100909）

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