加压毛细管电色谱测定乳及乳制品中三聚氰胺

郭启雷，史海良，赵丽，杨红梅，王浩

（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

加压毛细管电色谱测定乳及乳制品中三聚氰胺

郭启雷，史海良，赵丽，杨红梅，王浩

（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

研究建立利用加压毛细管电色谱（pCEC）测定乳及乳制品中三聚氰胺的分析方法。样品采用2%三氯乙酸水溶液超声提取，阳离子固相萃取柱（MCX）净化，提取液经C18反相毛细管电色谱柱分离，流动相乙腈-10 mmol/L辛烷磺酸钠溶液（pH 3.0）=15+85，泵流速0.05 mL/min，分离电压-2 kV，紫外检测器240 nm检测。该方法在1.0 mg/kg～100 mg/kg质量浓度范围内线性关系良好（R2=0.999），在牛奶和酸奶中的定量限为2.5 mg/kg，在奶粉中的定量限为10 mg/kg，加标回收率为78.9%～93.5%，相对标准偏差小于5%。

加压毛细管电色谱；乳及乳制品；三聚氰胺

目前检测三聚氰胺的方法主要有气相色谱-质谱法（GC-MS）[1-2]、高效液相色谱法（HPLC）[3-4]和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）[5-6]等。其中GC-MS法样品需要衍生化，操作比较复杂；HPLC法是目前最常用的分析方法；HPLC-MS/MS灵敏度高，抗干扰能力强，但仪器购置、维护成本较高。毛细管电色谱（Capillary Electro-Chromatography，CEC）是将毛细管柱内填充或键合固定相，以电渗流为驱动力，结合了微径高效液相色谱与毛细管电泳两者的特点，具有高柱效、快速分离、高选择性、高精度以及试剂和样品用量少等优点，但单纯的CEC模式易产生气泡、干柱等问题[7]。而加压毛细管电色谱（Pressurized Capillary Electro-Chromatography，pCEC）通过微型液相色谱泵在毛细管电色谱柱一端施加压力，压力的引入使CEC分离过程受pH和缓冲液的限制相对减少，可有效地解决CEC的气泡问题，且能实现梯度洗脱；用电渗流和泵压同时驱动流动相，溶质依据它们在流动相与固定相中分配系数的不同和自身电泳淌度的差异得到分离，对复杂样品显示出极大的分离能力[7]。pCEC技术近年来开始应用于食品安全领域[8-10]，本研究建立了应用pCEC分析乳及乳制品中三聚氰胺的新方法，与HPLC1mL/min的流速以及UPLC、LC-MS/MS采用的0.2 mL/min流速相比，pCEC采用0.05 mL/min的流速极大地减少了有机溶剂的使用，经济、环保。在定性方面，pCEC可以通过施加不同的电压进一步判断样品中是否含有三聚氰胺，在不采用LC-MS/MS等昂贵仪器设备的情况下，同样可以增加定性的准确性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、乙腈：美国Thermo Fisher公司，色谱纯；冰乙酸、氨水：北京化工厂，分析纯；辛烷磺酸钠：天津市津科精细化工研究所，分析纯；三氯乙酸：北京市兴津化工厂；三聚氰胺：国家标准物质中心；Oasis MCX（60 mg，3 mL）：美国waters公司。

加压毛细管电色谱仪：TriSepTM-2100（Unimicro Technologies，Inc.，Pleasanton，CA，USA），包括2台高压输液泵、±30 kV高压电源、微流控制系统、紫外检测器和数据处理系统；Milli-Q纯水系统：美国Millipore公司；电子天平、感量0.000 1 g、0.01 g：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HY-5回旋振荡器：国华电器有限公司；超声波清洗器KQ5200：昆山市超声仪器有限公司；氮吹仪：美国Organomation association Inc.公司产品。

1.2 方法

1.2.1 pCEC条件

毛细管电色谱柱EP-100-20/45-3-C18（苏州环球色谱有限公司），内径100 μm，有效柱长20 cm，总长45 cm，填料为粒径3 μm ODS，流动相：乙腈-10 mmol/L辛烷磺酸钠溶液（冰乙酸调节pH 3.0）=15+85，流速：0.05 mL/min，检测波长240 nm，电压-2 kV。

1.2.2 标准曲线的制备

准确称取0.1 g（精确至0.000 1 g）三聚氰胺标准品，用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成1.00 mg/mL的标准储备液。然后用水逐级稀释成1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL系列浓度标准工作溶液，经0.45 μm滤膜过滤后进加压毛细管电色谱仪测定，峰面积对浓度作图。

1.2.3 样品处理

称取牛奶、酸奶样品10 g（精确至0.01 g）于25 mL比色管中，加入2%三氯乙酸水溶液至刻度，涡旋混匀后，超声提取20 min，提取液经滤纸过滤，待净化。

称取奶粉样品2.5 g（精确至0.01 g）于50 mL比色管中，加入10 mL水，涡旋混匀使奶粉充分溶解，加入2%三氯乙酸水溶液定容至25 mL，涡旋混匀后，超声提取20 min，提取液经滤纸过滤，待净化。

取5 mL上述提取液过MCX小柱（预先经3 mL甲醇、3 mL水活化），待提取液全部通过MCX小柱后，依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，加入6 mL5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，50℃水浴氮吹至干，用1 mL流动相经涡旋、超声充分溶解，过0.45 μm有机相滤膜，供pCEC测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相中有机相条件的优化

三聚氰胺的极性较大，需要在流动相中加入离子对试剂来延长保留时间。采用10 mmol/L的辛烷磺酸钠为离子对试剂，冰乙酸调节pH至3.0。实验考察了流动相中有机相的比例对三聚氰胺色谱分离的影响，如图1所示。

图1 流动相中有机相比例对pCEC分离三聚氰胺的影响Fig.1 Electrochromatograms of melamine with different concentration of organic solvent

随着流动相中乙腈比例增加，三聚氰胺的保留时间越来越短，分析速度加快，同时色谱峰的峰宽越来越小，综合考虑色谱分离的周期和实际样品基质的复杂性，最后选择流动相为15%乙腈的实验条件进行色谱分离。

2.2 施加电压的研究

实验考察了施加不同的电压对三聚氰胺色谱行为的影响，见图2。

从图2中可以看出，0 kV时，三聚氰胺在色谱柱上保留时间较长，峰面积较小，检测灵敏度较低；随着负电压的增加，电渗流、电泳的方向与泵压方向相同，保留时间减小。综合考虑分离度和分析时间，选择-2 kV为分析条件。对于阳性样品，可以通过改变电压，观察样品峰与标准品色谱峰的保留时间符合程度来进一步判断样品中是否含有三聚氰胺，相较普通液相色谱来说，增加了定性的准确性。

2.3 提取条件的选择

GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》采用1%三氯乙酸溶液加少量乙腈的方法来提取三聚氰胺，在实际应用中发现，该方法对于部分配方奶粉处理效果不好。本课题改用2%三氯乙酸水溶液提取，提高了三氯乙酸的浓度，蛋白沉淀效果明显改善，用该方法对上述不易处理的配方奶粉样品进行提取，均取得了良好的结果。提取液经MCX阳离子固相萃取柱净化，供pCEC测定。图3～图5比较了乳制品经MCX净化前后的色谱图，以及加标的色谱图。被分析样品的各个组分受到泵压、电压和电渗流等3个驱动力的综合作用，在3个驱动力的综合作用下，三聚氰胺与食品的基质成分得到了很好分离，从图中可以看出，本试验建立的仪器条件和前处理方法对三聚氰胺的测定没有干扰，确保了定性、定量的准确性。

图2 三聚氰胺在不同电压下的pCEC色谱图Fig.2 Electrochromatograms of melamine with different voltage

图3 牛奶基质在不同净化条件的pCEC比较Fig.3 Electrochromatograms of melamine in milk with different pretreatment.1-melamine

图4 酸奶基质在不同净化条件的pCEC比较Fig.4 Electrochromatograms of melamine in yoghourt with different pretreatment.1-melamine

图5 奶粉基质在不同净化条件的pCEC比较Fig.5 Electrochromatograms of melamine in milk powder with different pretreatment.1-melamine

2.4 检出限、线性范围和回收率

在空白样品中添加一定浓度的标准工作溶液，按照上述实验方法进行处理，用pCEC测定，以10倍信噪比计算本方法在牛奶和酸奶中的定量限为2.5 mg/kg，在奶粉中的定量限为10 mg/kg。按照1.2.2制备系列浓度标准工作溶液，按浓度由低到高依次经加压毛细管电色谱仪测定，峰面积对浓度作图，得到三聚氰胺的线性方程A=103.5C+9.82，r2=0.999，线性范围1.0 mg/kg～100 mg/kg。

采用经测定不含有三聚氰胺的3种样品，进行添加回收和精密度实验，加标浓度为20、50、100 mg/kg，按本文实验方法进行处理，用pCEC进样测定。平均添加回收率（每个添加浓度平行测定5次）为78.9%～93.5%，相对标准偏差小于5%，结果见表1。

表1 3种样品中三聚氰胺的回收率和精密度Table 1 Recovery and precision of melamine

采用本方法对市场上的30例乳及乳制品样品进行检测，均未发现阳性样品，表明目前对三聚氰胺的违法添加得到了有效控制。

3 结论

本文以非食用物质三聚氰胺为研究对象，选取牛奶、酸奶、奶粉等食品基质，样品采用三氯乙酸水溶液超声提取，提取液经阳离子固相萃取柱净化，采用反相毛细管电色谱柱分离，泵流速0.05 mL/min，分离电压-2 kV，流动相乙腈-10 mmol/L（15+85，v/v）等度洗脱。该方法在1.0 mg/kg～100 mg/kg质量浓度范围内呈线性关系（R2=0.999），在牛奶和酸奶中的定量限为2.5 mg/kg，在奶粉中的定量限为10 mg/kg，加标回收率为78.9%～93.5%，相对标准偏差小于5%。pCEC采用0.05 mL/min的流速极大地减少了有机溶剂的使用，经济、环保。另外，相较普通高效液相色谱来说，pCEC可以通过施加不同的电压进一步判断样品中是否含有三聚氰胺，在不采用质谱等昂贵仪器设备的情况下，同样可以增加定性的准确性，为乳及乳制品中三聚氰胺的检测提供了新的技术手段。

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Determination of Melamine in Milk and Dairy Product by Pressurized Capillary Electro-Chromatography

GUO Qi-lei，SHI Hai-liang，ZHAO Li，YANG Hong-mei，WANG Hao
（National Food Quality&Safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

An effective and convenient method for determination of melamine in milk and dairy product was developed.Pressurized capillary electro-chromatography （pCEC）was used as separation technology.The samples were extracted by ultrasonic with 2%trichloroacetic acid solution，cleaned up by mixed cation exchange solid phase extraction （MCX SPE）.The separation was performed on a reversed phase C18 column with 240 nm as the UV detection wavelength.The mobile phase was composed of acetonitrile and sodium octanesulfonate solution（15∶85，v/v，pH3.0），at a pump flow rate of 0.05 mL/min and separation voltage of -2 kV.Under the optimal conditions，the linear range of melamine was 1.0 mg/kg-100 mg/kg with correlation coefficient higher than 0.999.The LOQ was 2.5 mg/kg in milk and yoghurt，and 10 mg/kg in milk powder.The recoveries were 78.9%-93.5%and the relative standard deviations（RSD）were less than 5%.

pressurized capillary electro-chromatography（pCEC）；milk and dairy product；melamine

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.021

北京市科技计划项目（Z111100056811006）

郭启雷（1979—），男（汉），研究员，博士，研究方向：食品安全。

2014-04-03