H PLC法测定莲子中还原型谷胱甘肽（G SH）和总巯基（-SH）含量

魏斌，李鹏，崔胜云

（延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林延吉133002）

H PLC法测定莲子中还原型谷胱甘肽（G SH）和总巯基（-SH）含量

魏斌，李鹏，崔胜云*

（延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林延吉133002）

利用5，5'-二硫双-2-硝基苯甲酸（DTNB）为衍生化试剂，采用细胞破壁、衍生化为一体的同步衍生化提取、HPLC法测定了莲子中GSH和总巯基（-SH）含量。本文对样品前处理过程和色谱流动相的选择分别进行了优化，有效的阻止了前处理过程中巯基氧化变性对测定灵敏度降低而导致的漏检及消除了衍生化产物3，5-硝基-3-巯基-苯甲酸（NTB）色谱峰拖尾所造成的干扰，并借此选择性测定了莲子中GSH和总巯基（-SH）含量。结果表明；三次测定莲子中GSH和总巯基（-SH）含量均值分别为0.971 1 μmol/g和1.368 6 μmol/g，方法的回收率分别为101.02%和100.09%，检测限分别为4.21 μmol/L和4.63 μmol/L。

莲子；高效液相色谱法；谷胱甘肽；巯基化合物；5，5，-二硫双-2-硝基苯甲酸

莲子（Lotus Seed）是睡莲科莲属（Nelumbo nucifere Gaertn）植物种子经剥壳取芯后的果实，是一种药食兼用的保健食品。莲子具有抗衰老、抗氧化、维持人体血糖稳定、调节免疫功能等重要的生物学功能，在功能食品、药品等领域具有较大的应用价值[1-2]。莲子除了含有较多的碳水化合物、蛋白质、维生素及人体必须的多种氨基酸及钙、磷、铁、锌等微量元素外还含类黄酮、水溶性多糖、超氧化物歧化酶（SOD）等微量活性成分[3-5]。尽管与莲子活性成分及生理活性相关的文献报道较多，但像GSH等含半胱氨酸残基的含巯基活性成分测定鲜见报道。

生物体内含半胱氨酸残基的巯基肽及蛋白质扮演提高机体免疫、抗氧化、重金属解毒和代谢、促氨基酸吸收、细胞信号转导等重要生物活性功能，是生物正常代谢所必需的重要活性成分，其含量的多寡与机体的健康具有重要的相关性[6-10]。生物样品中GSH等含半胱氨酸残基的巯基化合物的测定方法迄今报道较多的是利用衍生化试剂的光谱法和色谱法等[11-14]。其中利用衍生化试剂的光谱法因其方法简单、操作简便被广泛采用。但该方法测定选择性低，干扰较大、无法准确提供不同巯基化合物相对含量信息。柱前衍生化HPLC法测定生物样品中的巯基化合物是选择性较高的分析方法。衍生化试剂5，5'-二硫双-2-硝基苯甲酸（Ellman试剂，DTNB）是光谱法和色谱法测定GSH等巯基化合物的常用的衍生化试剂。该衍生化试剂与半胱氨酸残基巯基发生二硫键的交换反应，生成巯基化合物-衍生化产物的复合物，同时定量释放出衍生化反应产物，3，5-硝基-3-巯基-苯甲酸（NTB）。通过测定小分子巯基化合物-衍生化产物复合物及定量释放的NTB可选择性测定小分子巯基化合物及包括巯基蛋白在内的总巯基含量。

目前，利用DTNB衍生化试剂HPLC法测定生物样品中巯基化合物面临若干难题和需要改进的地方。主要包括：1.由于测定并非是生物细胞实时分析，分析样品制备过程包括细胞破壁、提取、去蛋白等前处理。由于巯基的还原性，前处理过程中的胞外氧化性氛围易导致巯基的氧化变性，从而引起衍生化效率的降低甚至漏检。2.衍生化反应产物NTB在洗脱过程中易导致结构变化会使色谱峰严重拖尾给准确定量带来困难。

为了解决上述问题，本研究采用含过量DTNB衍生化试剂的提取液，用细胞破壁、衍生化为一体的同步提取达到细胞破壁的同时瞬间同步衍生化来阻止巯基的氧化变性。同时通过对色谱流动相酸度和洗脱能力进行了优化，并采用梯度洗脱的方法克服了NTB的拖尾。通过上述改进，用DTNB柱前衍生化HPLC法测定了莲子中的GSH和总巯基（-SH）含量。本研究对莲子中活性成分的筛选、生物学功能的研究及选择性分析生物样品中巯基化合物方法学研究提供重要的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采用去莲子芯后的白莲子干品（福建产）作为样品。主要试剂有5，5′-二硫双-2-硝基苯甲酸（DTNB）（国药试剂）；还原型谷胱甘肽（国药试剂）；半胱氨酸（Aldrich 99%）；乙腈（色谱纯，Fisher）；四氢呋喃（色谱纯，Fisher）；甲酸（色谱纯，国药试剂，98%），其它试剂均为分析纯，实验用水为三次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

HP1100高效液相色谱仪、二极管阵列检测器：美国安捷伦公司；色谱柱为Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×150 mm）：日本GL Science公司；SCIENT-IID超声波细胞破碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；KQ-500DE数控超声波清洗器：江苏昆山超声仪器有限公司；pHS-3C型实验室酸度计：上海精密仪器有限公司；Mini-10K微型离心机：珠海黑白医学仪器有限公司；SZ-97全自动三重纯水蒸馏器：上海亚荣公司。

1.3 溶液的配制

标准品和衍生化试剂储备液：称取还原型谷胱甘肽（GSH）0.030 7 g，移入10 mL比色管中，加入三次蒸馏水稀释定容。制备最终浓度分别5.0×10-3mol/L的溶液。准确称取衍生化试剂DTNB 0.079 2 g，向其中加入磷酸盐缓冲溶液（PBs，0.2mol/L，pH=7）20 mL，制备DTNB最终浓度为1.0×10-2mol/L的缓冲溶液。

1.4 样品处理

取莲子样品干品，去芯、洗净沥干，用粉碎机粉研并磨成白色粉末。称取粉末样品4.0 g，加入20 mL含过量DTNB（1.0×10-2mol/L）的PBS缓冲液20 mL，利用超声细胞破壁仪超声破壁5 min、超声波清洗仪超声30 min，离心、量取10 mL上清液，加入2倍体积的乙醇，静置30 min，抽滤，然后8 000 r/min离心10 min除蛋白、取上清液作为供试品[15]。

1.5 色谱条件

分离色谱柱用C18反相色谱柱：日本GL science公司产Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×150 mm）。流动相选用二元流动相体系，分别由含1%甲酸的水相A；和含10%四氢呋喃的乙腈有机相B。采用梯度洗脱，其程序为：10%B（0 min）14%B（12 min）28%B（22 min）80%B（35 min）10%B（40 min）。流动相流速选为0.8 mL/min，柱温为25℃，进样量为10 μL。由于衍生化产物及DTNB在所选流动相中均在λmax=327 nm处均有较强的吸收强度，因此紫外检测器的检测波长设置为327 nm。

1.6 分析方法

由于DTNB衍生化试剂在PBS缓冲液（pH=7）中，与含半胱氨酸残基的小分子巯基化合物（RSH）和含巯基蛋白质（Prot-SH）发生定量衍生化反应并释放出1-硫-5-硝基苯甲酸（TNB）和巯基化合物与TNB的复合物（RS-TNB，Prot-S-TNB），见图1。

如图1所示，过量DTNB与样品中含巯基蛋白质（Prot-SH）和小分析巯基化合物（RSH）发生二硫键的交换反应并分别生成衍生化产物Prot-S-TNB和RSTNB并定量释放出TNB。由于蛋白质衍生化产物（Prot-S-TNB）可通过除蛋白分离掉，分析溶液中的RS-TNB和TNB分别提供小分子巯基化合物和总巯基（-SH）含量信息。借此，利用HPLC法分别测定GSH等小分子巯基化合物和总巯基（-SH）含量。

图1 巯基化合物与衍生化试剂DTNB的反应衍生化反应Fig.1 Derivatizing reactions between thiol compounds and DTNB

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

正如图2所示，巯基化合物衍生化反应定量释放的TNB提供总巯基含量信息。但利用紫外检测器的色谱仪同时测定R-TNB和TNB，因其两者的光谱特性的不同，在选定的检测波长（327 nm）条件下，TNB色谱峰严重拖尾导致无法定量测定总巯基含量。拖尾的原因可能为洗脱过程中TNB与其还原态3，5-硝基-3-巯基-苯甲酸（NTB）相互转换所致，TNB及NTB的结构见图2。

图2 TNB与其还原态NTB的化学结构式Fig.2 Chemical structure of TNB and its reduced form NTB

如图2所示，TNB在λmax=412 nm的可见光区有较强的吸收，是目前利用光度法测定GSH等巯基化合物的主要衍生化产物形态。而在酸性条件下，其还原态NTB在所设色谱检测波长（λ=327 nm）处具有强吸收。因此，利用所选检测波长下同时得到所有衍生化产物的灵敏、无拖尾的色谱峰，须把TNB转换成光谱特性与其他衍生化产物相匹配的还原态NTB。实验结果发现；通过水相中加入甲酸来提高流动相酸度使TNB充分转换成NTB的形态，大大改善了拖尾现象，但其保留值随甲酸浓度的增大而增大且峰型不对称。这可能是由于NTB的疏水性比起TNB疏水性大导致不易洗脱有关。若在有机相中同时加入四氢呋喃来调节洗脱能力可有效消除了拖尾和谱峰不对称保留值的位移。优化的流动相组成为；有机相加入10%四氢呋喃，水相中加入1%甲酸，梯度洗脱可得到满意的色谱峰。

2.2 莲子中GSH和总巯基（-SH）测定

2.2.1 莲子提取液及GSH标准品衍生化产物的对照测定

分别用过量DTNB（1.0×10-2mol/L）同步衍生化莲子提取液，DTNB和GSH标准混合溶液进行了HPLC对照测定，结果见图3。

图3 A为标准品GSH（1.5×10-3mol/L）+DTNB（2×10-3mol/L）混合液的色谱图；B为莲子提取液的色谱图Fig.3 A for chromatograms for GSH（1.5×10-3mol/L）+DNNB（2× 10-3mol/L）mixture B for the extract of Lotus Seeds.

如图3所示，在过量DTNB和GSH标准混合溶液中，分别观察到衍生化产物GS-TNB、游离的NTB及剩余衍生化试剂DTNB的色谱峰。同样在莲子提取液中也观察到了对应的衍生化产物和剩余衍生化试剂的色谱峰，说明量子提取液小分子巯基化合物主要为GSH。比较两者NTB和GS-TNB色谱信号发现，标准混合溶液的两者峰面积之比为（402.1∶364.9=1.10），而莲子提取液对应的面积之比为（368.9∶239.3=1.54）。由于NTB和GS-TNB的色谱峰面积均与GSH的浓度呈线性增加，因此莲子提取液中NTB和GS-TNB谱峰面积之比大于标准混合溶液中的色谱峰面积之比意味着莲子提取液中的NTB是除了GSH衍生化之外还有其它含半胱氨酸残基的蛋白质的衍生化反应而释放出来的，说明莲子中除了GSH外还含有含半胱氨酸残基蛋白质等其它巯基化合物。

2.2.2 前处理对色谱测定的影响

植物细胞内GSH等含半胱氨酸残基的巯基化合物中巯基是重要的活性官能团且其巯基具有还原性。因此，巯基只在细胞内特定氧化还原氛围中相对稳定并发挥其生物学功能。对其胞内的巯基化合物的分析测试中，衍生化之前的溶剂提取、去蛋白等胞外环境的操作会受胞外氧化氛围的影响使得巯基氧化变性，导致严重降低衍生化效率和测定灵敏度[6]。

为了探讨破壁之后前处理操作不当导致的巯基氧化变性对测定的影响，分别用如下前处理方法得到莲子提取液并对测定结果进行了比较。第一种前处理方法是；利用含过量衍生化试剂DTNB的缓冲液作为提取液，采用细胞破壁、衍生化为一体的提取方法，然后对提取液除蛋白得到供试品（1）。第二种前处理方法是；先用缓冲液进行细胞破壁提取，然后依次进行衍生化、去蛋白得到供试品（2）。第三种前处理方法是；先用缓冲液进行细胞破壁提取，然后依次进行去蛋白和衍生化操作得到供试品（3）。这三种前处理方法的区别主要是；前者是细胞破壁瞬间巯基通过衍生化反应得到有效封闭，从而避免其在衍生化和去蛋白等胞外环境下的氧化变性，而后两者操作是衍生化之前进行细胞破壁及除蛋白。色谱测定结果表明；三种供试品的衍生化产物色谱信号灵敏度具有较大的差异，对应的衍生化产物的色谱峰面积见下表1。

表1 不同前处理的得到的莲子供试品的色谱峰面积Table 1 Chromatographic areas by lotus seed samples obtained by different pretreatments （mAU）

如表1所示，供试品1的衍生化产物色谱峰信号最强，供试品2对应的衍生化产物的色谱信号明显降低，而供试品3观察不到对应的色谱信号。这一结果说明：细胞内的巯基化合物，破壁之后的提取、去蛋白过程中巯基极易氧化变性，明显降低衍生化效率，从而得不到灵敏的分析信号。这可能也是目前许多生物样品中巯基化合物漏检和错检的重要原因之一。

2.2.3 校正曲线和样品测定

由于含半胱氨酸残基的蛋白质及小分子巯基化合物中的巯基与DTNB的衍生化反应无选择性，同时GSH的衍生化产物（GS-TNB）及NTB的色谱峰面积与GSH浓度均呈良好线性关系，因此可用GSH标准溶液利用校正曲线法测定样品种的GSH和总巯基含量。校正曲线制作过程为；利用新鲜配置的含过量DTNB（1.0×10-2mol/L）衍生化试剂的PBs缓冲液分别配置一系列GSH浓度的标准系列溶液，分别在已优化的色谱条件进行了HPLC测定。结果表明；衍生化产物GSTNB和NTB的色谱峰面积与GSH浓度之间呈良好的线性关系。利用该线性关系制作的校正曲线、线性回归方程及对应的典型色谱图见下图。

如图4所示，利用三次平行测定的衍生化产物GS-TNB和NTB的色谱峰面积与GSH浓度间呈良好的线性关系，其线性回归方程分别为Y=8.317 32+ 35.522 48X和Y=28.665 33+37.262 9X，相关系数r分别为0.999 98和0.999 96。利用校正法测定了莲子中的GSH和总巯基含量，结果见下表2。

图4 GSH（A）和总巯基（B）含量测定的校正曲线Fig.4 Calibration plots for determination of GSH（A）and total thiols（B）

表2 莲子中GSH和总巯基（-SH）含量Table 2 Amount of GSH and total-SH in Lotus Seed μmol/g

2.3 回收率和检测限

利用加标回收率进一步验证了测定方法的准确度。分别取一定量的莲子提取液，然后分别加入一定浓度的不同量的GSH标准溶液，根据测定的GSH和总巯基（-SH）的色谱测定结果分别计算加标回收率。检测限是通过选择空白样品平行测定的方法，利用公式YE=μ+ks（YE指可被检测出的最小分析信号值，μ指空白的平均信号值，s为空白测定的标准偏差，k是与置信度有关的整数，这里取k=3）计算出被检出的最小分析信号，然后分别利用校正曲线的线性回归方程分别计算出GSH和-SH测定的检测限。测定结果见下表3。

表3 方法的回收率和检测限Table 3 Recoveries and detection limits

如表3结果所示，GSH测定的回收率均值为101.02%，检测限为4.21 μmol/L总巯基（-SH）测定的回收率均值为100.09%，检测限为4.63 μmol/L，满足本测定的准确度和灵敏度要求。

3 结论

1）在流动相中加入不同比例的四氢呋喃和甲酸来对流动相酸度和洗脱能力进行了优化，消除了衍生化产物NTB色谱峰拖尾的干扰，确立了用高效液相色谱法同时测定莲子中GSH和总巯基（-SH）含量的方法。

2）采用细胞破壁同步衍生化的前处理方法，有效阻止巯基在前处理过程中氧化变性，避免巯基氧化变性导致的灵敏度降低及漏检，为准确测定生物样品中活性巯基化合物的测定提供了方法学依据。

3）莲子中GSH含量为0.971 1 μmol/g，总巯基含量为1.368 6 μmol/g。由于莲子中其它含巯基小分子巯基化合物，像半胱氨酸含量较少，总巯基含量与GSH含量差值0.397 5 μmol/L为莲子含有蛋白质中的巯基含量，说明莲子是富含GSH及含巯基活性蛋白质的物种。

[1]Ji Hoon Oh,BongJae Choi,Mun Seog Chang,et al.Nelumbo nucifera semen extract improves memory in rats with scopolamine-induced amnesia through the induction of choline acetyltransferase expression,Neuroscience Letters,2009,461:41-44

[2]Insop Shim,Hyunsu Bae,Moonkyu Kang,Kwang-Ho Pyun,International Congress Series,2006,1287:345-349

[3]曹绍校,陈秉彦,郭泽镔,等.莲子生理活性的研究进展[J].热带生物学报.2012,33(11):2110-2114

[4]郑宝东,郑金贵,曾绍校.我国主要莲子品种营养成分的分析[J].营养学报,2003,25:153－156

[5]潘林娜,梁华俤,郭桂玲.莲子的营养价值与加工工艺[J].食品工业科技,1993,1:29-32

[6]Xiao-Yong Zhang,Yu-Lian Piao,Sheng-Yun Cui,et al.Determination of reduced glutathione,cystein and total thils in pine pollen powder by in situ derivatizatioin[J].Micochemical Journal,2014, 112:1-6

[7]朱亚玲,张小勇,崔胜云.利用衍生化试剂DTNB测定枸杞中谷胱甘肽[J].食品科学,2011,32(6):250-255

[8]金春英,崔京兰,崔胜云.氧化型谷胱甘肽对还原型谷胱甘肽清除自由基的协同作用[J].分析化学,2009,37(9):1349-1353

[9]ClausJacob,Gregory I.Giles,Niroshini M.Giles,and Helmut Sies, Angew.Chem.Ed,2003,42:4742-4758

[10]陈亚琴,印大中.氧化应激衰老与氧化电位的迷思[J].国际老年医学杂志,2011,32(1):13-24

[11]TeizeF.Enzymaticmethod for quantitative determination of nanogram amount of total and oxidized glutathione[J].Anal Biochem,1969,27 (3):502-522

[12]郑群雄,潘艳,熊春华.RP-HPLC法测定谷胱甘肽巯基含量[J].分析检测,2007(11):154-156

[13]WeiChen,Yong Zhao,Teresa Seefeldt,et al.Determination of thiols and disulfides via HPLC quantification of 5-thio-2notrobenzoic acid[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2008, 48:1375-1380

[14]范崇东,王淼,卫功元,等.谷胱甘肽测定研究进展[J].生物技术, 2004,14(1):68-70

[15]金京石,沈丽,崔胜云.衍生化法测定山药中还原型谷胱甘肽和总巯基含量[J].食品安全质量检测学报,2013(4):1155-1160

Dertermination of Reduced Glutathione（GSH）and Total Thiols in Lotus Seeds by High Performance Liquid Chromatography（HPLC）

WEI Bin，LI Peng，CUI Sheng-yun*
（Key Laboratory of Natural Resources&Functional Molecules of Changbai Mountain of Ministry of Education，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China）

Reduced glutathione（GSH）and total thiols in Lotus Seed were determined by HPLC assay utilizing 5，5'-dithio-bis（2-nitrobenzoic acid）（DTNB，Ellman's reagent）as the derivatizing agent with concomitant cell rupture during the sample pretreatment.Sample pretreatment and elution solutions were optimized in order to inhibit reduced sensitivity and serious tag of chromatographic signal for derivatized product 2-nitroso-5-thiol-benzoic acid （NTB），and selectively determined GSH and total thiols（-SH）in Lotus Seed.The results showed that the average amount of GSH and total thiols in Lotus Seed were 0.971 1 μmol/g and 1.368 6 μmol/g，the average recoveries of the methods were 101.02%and 100.09%，detection limits were 4.21μmol/L and 4.63 μmol/L respectively.

Lotus seed；HPLC；GSH；thiol compounds；DTNB

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.019

国家自然科学基金项目（21165021）

魏斌（1989—），男（汉），硕士研究生，从事植物活性成分测定研究。

*通信作者：崔胜云（1957—），男，教授。

2014-11-06