利用金枪鱼头提取硫酸软骨素的工艺探讨

奥文芳，段振华，张雄，李婧怡，胡静

（海南大学食品学院，海南海口570228）

利用金枪鱼头提取硫酸软骨素的工艺探讨

奥文芳，段振华*，张雄，李婧怡，胡静

（海南大学食品学院，海南海口570228）

以金枪鱼头为原料，初步探讨了硫酸软骨素的提取工艺，采用稀碱-酶解，超声辅助提取的方法，考察了碱提取过程中料液比、碱浓度、超声时间、碱提温度对提取率的影响，在单因素实验的基础上，利用正交实验进行了工艺优化，得出最佳提取工艺为料液比1∶25 g/mL、碱浓度2.25%、超声时间40 min、碱提温度60℃，最大提取率为1.226%。

金枪鱼；硫酸软骨素；提取；优化

硫酸软骨素（Chondroitin sulfate，简称CS）是来自于动物软骨组织的一类重要的酸性黏多糖——糖胺聚糖，是构成动物软骨、腱、皮肤等结合组织的重要组成部分[1-2]。近年来，随着对其研究的深入，发现CS具有抗凝、抗炎、抗血栓、抗癌及降低心肌耗氧量，促进冠状动脉循环、降血脂、抗凝血和防止血管硬化等作用[3]。同时，对冠心病、动脉粥样硬化、心绞痛、心肌缺氧、心肌梗塞等心血管疾病的治疗有一定疗效[4]。此外，CS还具有保水性、保胶性和高黏性，是许多化妆品和保健品的重要原料[5]。目前，CS的主要来源是家禽和鲨鱼的软骨，但由于原料有限或成本较高，使得CS的获取较难，价格较高，无法普及。因此，寻找低成本的、易得的原料成为主流。经李川等[6]研究表明罗非鱼头中能提取出硫酸软骨素，而关于金枪鱼头的研究较多的是氨基酸，矿物质及其它生物活性物质，对于硫酸软骨素这方面的研究鲜有报道。同时，世界金枪鱼年产量在350万t～430万t左右，产值达30亿美元，大部分金枪鱼常被用来制成生鱼片或者加工成罐头，在加工过程中产生大量下脚料，如鱼头、内脏、鳃、暗色肉和鱼皮等，约占总重量的50%～70%[7]。

CS的提取方法主要有：浓碱提取、稀碱浓盐提取、稀碱提取、稀碱—酶解提取法及双酶法等。利用浓碱工艺提取的产品颜色较深，且废碱液对环境的危害较大；用稀碱工艺提取的方法使得产品中蛋白质含量和氮含量较高，生产周期较长；利用稀碱浓盐工艺提取，产品的产率和纯度都不高。其中最常用的是稀碱—酶解提取法，但提取周期较长。超声辅助法是利用超声波的空化作用，使物料周围形成空穴，从而有利于硫酸软骨素提取的方法。蒲志军等采用超声波辅助的碱提酶解法提取猪喉骨中的硫酸软骨素时发现，与常规的碱提酶解法相比，硫酸软骨素的提取率和纯度并无明显提高，但超声辅助法可大大缩短提取时间[8]。本实验以低廉的金枪鱼头为原料，利用稀碱和酶解相结合，超声辅助提取的方法，对金枪鱼头的硫酸软骨素进行提取研究，在单因素实验基础上，利用正交实验对提取过程进行优化，为金枪鱼的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金枪鱼头：金枪鱼购自海口当地市场，其中的鱼肉用于罐头实验，鱼头冷冻备用。

复合蛋白酶（3.8×105 U/g）：Novo公司；其他试剂：国产分析纯；粒状活性炭：广州化学试剂厂。

1.2 主要仪器和设备

KS-300E超声波清洗机：宁波科生仪器厂；101-2型电热鼓风恒温干燥箱：常州市华普达教学仪器有限公司；7200可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；SF-200型粉碎机：泰州市博精制药机械有限公司；HH-S26S电热恒温水浴锅：金坛市大地自动化仪器厂；BS124S电子天平：Sartorius公司；PHS-3C型实验室pH计：上海伟业仪器厂；BCD-180冰箱：海信科龙电器股份有限公司。

1.3 主要工艺流程

预处理→超声处理→碱提取→沉淀蛋白→抽滤→酶解→吸附→抽滤→测定

1.3.1 预处理

将冷冻状态金枪鱼头流水解冻，置于80℃恒温水浴加热1 h捞起、洗净、去除鱼肉等杂质，于电热鼓风干燥箱中65℃干燥4 h，粉碎，得鱼头骨粉，置于冰箱中保存备用。

1.3.2 超声处理

称量1 g鱼骨粉，用5 mL石油醚浸泡5 min，振荡后静置，小心倾倒出石油醚；根据实验设计的要求加入NaOH溶液，随后进行超声波处理。

1.3.3 碱提取

超声处理完后取出烧杯，分别向烧杯中加入10 mL同一浓度的NaOH溶液，在35℃的水浴锅中浸提1 h，每15 min搅拌1次。

1.3.4 沉淀蛋白

取出烧杯后，调节pH2～3之间，除去酸性蛋白[9]，然后尽快调整pH7，静置，抽滤后测量其体积。

1.3.5 酶解

根据体积向滤液中添加2%的复合蛋白酶，在50℃水浴锅中水浴2 h[10]，维持pH7.0，酶解完成后，升温到85℃，灭酶5 min。

1.3.6 吸附

取出冷却，按2.0%的添加量加入活性炭，在65℃下吸附20 min后，抽滤[11]。

1.3.7 测定

取一定量的澄清滤液利用分光光度法测定硫酸软骨素的含量。

1.4 硫酸软骨素的测定

采用硫酸-咔唑法测定[12-13]标准曲线的绘制：根据参考文献[12]的方法操作，在525 nm波长处测定吸光度（A）。以吸光度（A）为纵坐标，CS的质量浓度C（g/L）为横坐标，绘制标准曲线，如图1所示，其回归方程为：A=2.38C-0.002 3，R2=0.998 5，而且质量浓度在0.00 g/L～0.30 g/L范围内具有良好的线性关系。其标准曲线见图1[11]。

图1 硫酸软骨素的标准曲线Fig.1 Standard curve of chondroitin sulfate

根据CS标准曲线，通过测定样液的吸光度值即可换算出硫酸软骨素的含量，进而可以得出提取率，其计算公式如下：

式中：c为CS的质量浓度，g/L；n为稀释倍数；v为样液体积，mL；m为原料的质量，g。

2 结果分析

2.1 料液比对提取率的影响

料液比对提取率的影响见图2。

图2 料液比对提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate

从图2中可以看出，在碱浓度1%、碱提时间60 min、碱提温度35℃、超声时间30 min时，以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的料液比分别提取，结果显示，在1∶10到1∶20之间，硫酸软骨素的提取率随着料液比的增加而增加。其原因为浸提过程中溶质由高浓度向低浓度扩散，增大料液比可以增大原料与浸提液中硫酸软骨素的浓度差，有利于硫酸软骨素的提取。但1∶20后，由于蛋白质与粘多糖在碱性水溶液中有很好的溶解性，料液比的增大使得浸提液中的这些杂质增多，硫酸软骨素的含量相对减少，所以提取率降低。1∶30、1∶40、1∶50基本平衡，增加料液比的意义相对较小。综合考虑，选取1∶20的料液比进行提取较为经济。

2.2 碱浓度对提取率的影响

碱浓度对提取率的影响见图3。

图3 碱浓度对提取率的影响Fig.3 Effect of alkali concentration ratio on the extraction rate

由图3可以看出，在料液比1∶20、碱提时间60min、碱提温度35℃、超声时间30 min时，以0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%碱浓度分别提取，结果表明，在0.50%到2.00%之间，硫酸软骨素的提取率随着碱浓度增大而增大。但是，在0.20%后提取率显然有所降低，这可能是因为在高浓度碱条件下，处于糖链还原端的糖基在碱性条件下，逐渐生成间糖酸和异糖酸而脱落降解[14]，使产率降低。因此，2.00%的碱浓度时提取率较高。

2.3 碱提时间对提取率的影响

碱提时间对提取率的影响见图4。

图4 碱提时间对提取率的影响Fig.4 Effect of alkali extraction time on the extraction rate

从图4可以看出，在料液比1∶20、碱浓度2.00%、碱提温度35℃、超声时间30 min时，以30、60、90、120、150 min分别提取，结果如图所示。在30到60之间，提取率随着碱提时间的延长而增大，60 min后提取率明显降低。这可能是因为原料中的蛋白多糖发生的β-消去反应[15]，硫酸软骨素与蛋白的分离的同时产生副反应，使产率下降。因此，60min的碱提时间最为合适。

2.4 碱提温度对提取率的影响

碱提温度对提取率的影响见图5。

图5 碱提温度对提取率的影响Fig.5 Effect of alkali extraction temperature on the extraction rate

料液比1∶20、碱浓度2.00%、碱提时间60 min、超声时间30 min时，分别取温度35、45、55、65、75℃。从图5可以看出35到45的温度变化对提取率的影响甚小，45到55的提取率随着温度的升高而增加，这是由于温度的升高会使蛋白多糖发生的β-消去反应加快[15]，使产率升高。但当温度超过55℃后，可能是由于软骨素和蛋白质的分解加快并产生副反应，使产率下降。

2.5 超声时间对提取率的影响

超声时间对提取率的影响见图6。

图6 超声时间对提取率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic-assisted treatment time on the extraction rate

从图6可以看出，超声时间在10 min～40 min范围内时，提取率随着时间的延长而增加，在时间为40 min时达到最大值；但时间超过40 min后，提取率反而随着时间的延长而降低，这可能是由于长时间的作用使大分子的多糖断裂，从而使后处理过程中的损失增大而影响硫酸软骨素的提取率[11]。

2.6 正交试验结果与分析

在以上单因素实验结果基础之上，以CS提取率为指标，从中筛选出料液比、碱浓度、超声时间、碱提温度四因素三水平，设计L9（34）的正交实验表进行优化，以确定最佳碱提取工艺条件，见表1，实验结果见表2。

由表2分析可知：料液比、碱浓度、超声时间、碱提温度对硫酸软骨素得率都有影响，其中料液比（A）的极差最大，影响最为显著；碱提温度（D）极差较大，影响较为显著；碱浓度（B）极差较小，对产率的影响较小；超声时间（C）的极差最小，影响最小。结果表明，当料液比为1∶25，碱浓度为2.25%，超声时间为40 min，碱提温度为60℃，即A3D3B3C2时硫酸软骨素的产率达到最大。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factor levels of orthogonal experiment

表2 碱提取条件正交试验结果Table 2 The results of orthogonal experiment of alkali extraction conditions

2.7 验证实验

在A3D3B3C2的条件下进行3组平行实验，见表3。

表3 碱提取条件验证实验结果Table 3 The results of verified experiment of alkali extraction conditions

由表3可知，在A3D3B3C2的条件下3组平行实验的平均得率为1.226%，与正交实验中最高提取率A3D3B2C1相比较，A3D3B3C2＞A3D3B2C1，所以该实验结论正确。

3 结论

1）本研究以金枪鱼头为原料，利用超声波辅助稀碱—酶解法提取硫酸软骨素。

2）在单因素实验结果的基础上，利用正交实验进行优化，得到各因素的关系为：料液比＞碱提温度＞碱浓度＞超声时间。

3）本研究最佳优化工艺为：料液比1∶25、碱浓度2.25%、超声时间40 min、碱提温度60℃，此工艺下硫酸软骨素的平均提取率为1.226%。

[1]CATERSON B,MAHMOODIAN F,SORRELL J M,et al.Modulation of native chondroitin sulphate structure in tissue development and in disease[J].Journal of Cell Science,1990,97(3):411-417

[2]李南.硫酸软骨素的开发及生产工艺控制[J].上海水产大学学报, 1998,7(1):38-43

[3]肖凯军,郭祀远,李琳,等.鲨鱼软骨粘多糖的提取[J].化工学报, 2001,52(8):2761

[4]华子义.硫酸软骨素生产新工艺[J].上海大学学报:自然科学版, 2001,7(4):3341

[5]吴立芳,马美湖.我国畜禽骨骼综合利用的研究进展[J].现代食品科技,2005,21(1):138-143

[6]李川,段振华,龙映均,等.罗非鱼头中硫酸软骨素提取的工艺优化[J].食品科学,2009,20(30):234-237

[7]韩云峰.世界金枪鱼产业发展状况[J].中国渔业经济,2007(1):34

[8]蒲志军,马林,嘉庆.超声波法制备硫酸软骨素生产工艺的研究[J].四川师范大学学报:自然科学版,2000,23(6):640,641

[9]吴辉辉,桑卫国,罗红宇,等.赤魟软骨黏多糖的制备的研究进展与应用前景[C].食品安全监督与法制建设国际研讨会,2005

[10]刘国庆,凌庆枝,孙军飞,等.蛋壳膜硫酸软骨素的提取工艺及其优化[J].食品科学,2007,28(9):283-286

[11]成长玉,段振华,樊洁,等.响应面法优化罗非鱼下脚料硫酸软骨素提取工艺的研究[J].食品科技,2011,36(3):214

[12]于兹东,杨桂明,高华,等.咔唑分光光度法测定硫酸软骨素[J].青岛大学学报,2005,18(3):41-44

[13]BITTER T,MUIR H M.A modified uronic acid carbazole reaction [J].Analytical Biochemistry,1962,4(4):330-335.

[14]张虹,柳正良,王洪泉,等.超临界萃取结合水煎煮法萃取丹参中有效成分的研究[J].中草药,2004,35(12):1360-1362

[15]李鑫.硫酸软骨素提取和纯化方法的研究[D].成都:四川大学, 2005

Study on the Extraction Technology of Chondroitin Sulfate from Tuna Skull

AO Wen-fang，DUAN Zhen-hua*，ZHANG Xiong，LI Jing-yi，HU Jing
（Colloge of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

The articles introduced a method of extraction chondroitin sulfate from tuna skull.The effects of solid-liquid ratio，alkali concentration，ultrasonic-assisted treatment time，extraction temperature on the extraction rate was studied by using dilute alkali-enzymatic hydrolysis and ultrasonic assisted extraction method.On the basis of single-factor tests these parameter of extraction process was optimized by orthogonal experiment.The results showed that the solid-liquid ratio was 1∶25，the alkali concentration was 2.25%，the time of ultrasonic treatment was 40 min and the alkali extraction temperature was 60℃，the extraction percent of chondroitin sulfate could be improved up to 1.226%.

tuna；chondroitin sulfate；extraction；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.009

海南省科学事业费项目(11-20410-0005)

奥文芳（1991—），女（汉），在读本科生，研究方向：水产品加工技术。

*通信作者：段振华（1965—），男，教授，博士，研究方向：水产品食品科技。

2013-12-04