贝伐单抗联合放疗对肺癌裸鼠移植瘤作用的研究

阳秋香　张欢欢　袁太泽　梁颖　余锦秀　王文金　张秀萍

广州医科大学附属肿瘤医院放疗科，广东广州510095

贝伐单抗联合放疗对肺癌裸鼠移植瘤作用的研究

阳秋香张欢欢袁太泽梁颖余锦秀王文金张秀萍

广州医科大学附属肿瘤医院放疗科，广东广州510095

目的探讨贝伐单抗联合放疗对人肺癌A549细胞株裸鼠移植瘤的作用。方法将人肺癌A549细胞接种于24只裸鼠后腿皮下，10 d后肿瘤体积在100～200 mm3之间，按随机数字表法分为对照组（无菌生理盐水注射）、贝伐单抗组（每次注射贝伐单抗10 mg/kg，每周1次，共3次）、放疗组（5 Gy/次，共2次）、贝伐单抗联合放疗组（联用贝伐单抗和放疗）。治疗过程中测量肿瘤大小及重量，41 d后处死裸鼠，切取移植瘤组织。采用免疫组织化学方法检测各组标本的肿瘤微血管密度（MVD）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况，并进行统计学分析。结果贝伐单抗联合放疗组移植瘤瘤体生长与对照组比较明显受抑制（P＜0.05），抑瘤率达82.8%；免疫组织化学显示贝伐单抗联合放疗组MVD、VEGF表达［（7.37±4.11）、（3.10±0.98）］较对照组［（14.40±5.01）、（6.00±1.90）］明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论贝伐单抗联合放疗可能通过抑制VEGF表达而增强非小细胞肺癌的放射敏感性。

贝伐单抗；放疗；移植瘤；肺癌

肺癌是目前世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌总数的80%～85%，大多数患者就诊时已处于晚期，主要采用放、化疗及靶向治疗等综合治疗，因肿瘤巨大和/或放射抗拒等原因，疗效往往不理想，5年总生存率约为17%［1］。因而通过将放疗与靶向治疗联合来改善放疗抵抗、提高放疗疗效成为目前研究的热点。贝伐单抗（Bevacizumab）是一种以血管内皮生长因子（vascular edothelial growth factor，VEGF）为靶点的分子靶向药物，已经被美国食品与药物管理局（FDA）批准用于治疗转移性结直肠癌、转移性非小细胞肺癌、转移性肾癌等恶性肿瘤［2］。研究表明贝伐单抗具有放射治疗增敏的作用［3］。于丹丹等［4］将贝伐单抗与放疗联合并观察其对乳腺癌移植瘤生长的影响，发现联合治疗组对肿瘤生长的抑制作用最为显著，并进一步发现联合治疗组缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、VEGF水平明显降低，提示贝伐单抗可能通过抑制肿瘤细胞增殖和减少血管生成，从而抑制肿瘤生长。另外，一些临床前研究及临床试验证明贝伐单抗可以与放射治疗联合应用于胶质瘤［5］、骨肉瘤［6］、直肠癌［7］等恶性肿瘤中。但目前贝伐单抗联合放射治疗应用于肺癌的报道较少。本研究旨在探讨贝伐单抗联合放疗对非小细胞肺癌的作用。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物及细胞株24只3～4周龄的BALB/C（nu/nu）裸小鼠（SPF级，合格证号：44007200003832）购自广东省实验动物中心，雌雄各半，体重13～14 g，于广州医科大学动物实验中心SPF级层流柜内饲养；人肺癌细胞株A549由广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所提供。

1.1.2药物及主要试剂贝伐单抗购自瑞士罗氏制药公司，100 mg/支；CD34兔单克隆抗体及VEGF小鼠单克隆抗体均购自美国Abcam公司；免疫组化试剂盒（PV6001/6002/6003）及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.1.3放疗仪器于中山大学肿瘤医院实验中心照射，RS 2000 X-线辐射仪，由Rad Source Technologies公司生产，电压为160 kV，电流25 mA，0.3 mm铜过滤，剂量率为623 cGy/min。

1.2方法

1.2.1肺癌细胞培养及肺癌裸鼠移植瘤动物模型建立将人A549肺癌细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，在37℃、5%CO2条件的培养箱中培养。取对数生长期的A549细胞制成5×107/mL单细胞悬液，取0.1 mL接种于裸鼠右侧大腿根部皮下。

1.2.2贝伐单抗联合放射治疗对肺癌裸鼠移植瘤的作用实验建立裸鼠移植瘤模型24只，待移植瘤生长10 d，至体积100～200 mm3后，按随机数字表法分为4组：对照组、贝伐单抗组、放疗组和贝伐单抗联合放疗组，每组6只裸鼠。贝伐单抗组及贝伐单抗联合放疗组分别于分组后第1、8、17天首先给予贝伐单抗（每只10 mg/kg，生理盐水稀释成0.1 mL）腹腔注射。对照组及放疗组给予腹腔注射等量灭菌生理盐水。于分组后第2、9天放疗组及贝伐单抗联合放疗组同时给予放射治疗，每只裸鼠固定在专门设计的铅制夹具中，充分暴露肿瘤组织，其余不需照射的部位用铅挡遮住，5 Gy/次，每周1次，共10 Gy/2次。接种前和接种后，每3天称裸鼠体重，并用游标卡尺测量移植瘤的最长径（a）和最短径（b），按公式V=ab2×0.52（mm3）计算肿瘤体积。接种后第41天，断颈处死动物，取出肿瘤，称重。抑瘤率的计算公式为：肿瘤生长抑制率=（对照组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量）/对照组平均瘤质量×100%。

1.2.3免疫组织化学染色CD34兔单克隆抗体及VEGF小鼠单克隆抗体浓度分别为1∶200和1∶100。取出肿瘤组织，10%中性甲醛固定，常规脱水包埋，4 μm连续切片，抗原热修复，分别滴加一抗和二抗，DAB显色，苏木精复染，光学显微镜下观察并拍照。肿瘤微血管密度（MVD）的计数标准：以CD34标记微血管，依据Veidner标准对着染的血管进行密度分级。先在低倍镜（100×）下全面观察切片，在肿瘤浸润区域选取血管内皮细胞染色清晰、背景对比良好、微血管数量最密集的视野，在高倍镜（200×）下记录5个视野内的微血管数，取其平均值作为MVD值。VEGF阳性表达为细胞质呈黄色或棕黄色，VEGF的判定标准：①阳性细胞所占比例：阳性细胞数＜1/3为1分，1/3～2/3为2分，＞2/3为3分；②阳性着色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；③将阳性细胞比例与着色强度计分相乘为最后评分。

1.3统计学方法

应用SPSS 21.0统计软件分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1贝伐单抗联合放疗对肺癌移植瘤生长的抑制作用

24只裸鼠全部成瘤，成瘤率为100%。分组时各组裸鼠体重及移植瘤体积无明显差异（P＞0.05）。放疗组及贝伐单抗联合放疗组移植瘤瘤体生长与对照组比较明显受抑制（P＜0.05），而贝伐单抗联合放疗组较放疗组生长虽有抑制，但差异无统计学意义（P＞0.05）（图1）。治疗结束后对照组、贝伐单抗组、放疗组、贝伐单抗联合放疗组的移植瘤质量分别为（2.68± 0.84）、（1.60±0.06）、（1.08±0.27）、（0.46±0.53）g。对瘤体重量进行比较发现，各治疗组的肿瘤质量均显著低于对照组（P＜0.01），且贝伐单抗联合放疗组的肿瘤质量最轻。贝伐单抗组和放疗组抑瘤率分别为40.3%和59.7%，两者联用抑瘤率达82.8%。

图1　贝伐单抗联合放疗对肺癌移植瘤的作用

2.2贝伐单抗联合放疗对裸鼠肿瘤微血管密度的影响

CD34反映肿瘤内部微血管分布（图2）。对照组、贝伐单抗组、放疗组、贝伐单抗联合放疗组的MVD值分别为（14.40±5.01）、（7.87±2.51）、（12.47±7.00）、（7.37± 4.11）。贝伐单抗组与贝伐单抗联合放疗组MVD值均明显低于对照组（P＜0.05）。单纯放疗组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3贝伐单抗联合放疗对裸鼠肿瘤VEGF表达的影响VEGF在肿瘤细胞胞浆和血管内皮细胞均有表达，主要在胞浆。对照组、贝伐单抗组、放疗组、贝伐单抗联合放疗组的VEGF阳性评分分别为（6.00±1.90）、（3.33±2.07）、（6.33±2.58）、（3.10±0.98）分。贝伐单抗组及贝伐单抗联合放疗组VEGF表达较对照组显著下调，且联合治疗组更明显，差异有统计学意义（P=0.015）。见图2。

3　讨论

放射治疗是Ⅲ期不可手术非小细胞肺癌治疗的一种重要手段。由于放疗抵抗，放射治疗剂量的增加提高了肿瘤控制率，但周围正常组织和器官的急、慢性毒副作用加重［8］。因此，国内外学者致力于寻找一种有效、毒副作用较小的放射增敏药物，提高放射治疗疗效。

恶性肿瘤的生长必须依赖足够的血液供应，切断肿瘤的血液供应则可抑制肿瘤生长，造成肿瘤细胞坏死。因此抗血管生成靶向治疗成为近几十年肿瘤治疗领域的热点。贝伐单抗是一种以VEGF为靶点的重组人单克隆IgG1抗体，可结合VEGF并阻止其与内皮细胞表面的受体（Flt-1和KDR）结合，抑制内皮细胞增殖和新生血管形成［9-10］。本研究发现，贝伐单抗能抑制肺癌移植瘤的生长，其抑瘤率为40.3%。此研究结果与文献报道［11］相一致，贝伐单抗靶向作用于处于增殖状态的血管内皮细胞，阻止VEGF所致血管再生，从而减少血供，促进肿瘤坏死。另外，本研究发现贝伐单抗联合放射治疗对肺癌移植瘤的生长抑制作用最大（P＜0.05），提示贝伐单抗在肺癌皮下移植瘤放射治疗模型中具有一定的放射增敏作用。Hoang等［12］在放疗联合贝伐单抗治疗头颈部鳞癌SCC1裸鼠模型的实验中，结果发现放疗联合贝伐单抗组移植瘤的生长明显受抑制，其抑制作用明显优于单纯放疗组和贝伐单抗组。Ou等［13］在NCI-H141动物模型中得出了类似结果，表明贝伐单抗可以显著提高放射治疗效果。

图2　贝伐单抗对各治疗组肿瘤微血管密度和血管内皮生长因子表达的影响（SP，400×）

VEGF是肿瘤血管生成中最重要的调节因子，可以诱导内皮细胞迁移、增殖和分化，促进肿瘤生长和转移。VEGF表达受多种因素影响，其中低氧是诱导VEGF的重要刺激因素，放疗本身也可以诱导VEGF高表达［14-15］。本研究进一步免疫组化分析显示贝伐单抗联合放疗组MVD、VEGF明显低于对照组和放疗组，可能与贝伐单抗下调VEGF表达有关。但具体机制尚不清楚。有研究显示可能与抗血管生成治疗引起的血管“正常化”有关［16］。即抗血管生成药物能改建肿瘤紊乱的血管网，使之结构、功能趋于正常化，从而改善局部血液循环，使乏氧区的氧供增加，减少乏氧细胞的产生，降低VEGF与放疗耐受相关因子的产生，最终使放疗敏感性增加。

总之，本研究初步表明贝伐单抗联合放疗可以显著增强抗肿瘤效应，但其具体机制尚待继续探讨，下调VEGF表达可能是其放射增敏的机制之一。但本研究并未涉及最佳给药和放疗时间及剂量的问题，因此尚需进一步探索。

［1］Farhat FS，Wissam Houhou.Targeted therapies in non-small cell lung carcinoma：what have we achieved so far？［J］.Ther Adv Med Oncol，2013，5（4）：249-270.

［2］Hershman DL，Wright JD，Lim E，et al.Contraindicated use of Bevacizumab and toxicity in elderly patients with cancer［J］.Journal of Clinical Oncology，2013，31（28）：3592-3599.

［3］Summers J，Cohen MH，Keegan P，et al.FDA drug approval summary：bevacizumab plus interferon for advanced renal cell Carcinoma［J］.The Oncologist，2010，15（1）：104-111.

［4］于丹丹，穆晓倩，顾闰，等.贝伐单抗对乳腺癌皮下移植瘤放疗的增敏作用及其机制［J］.中华实验外科杂志，2013，30（10）：2095-2097.

［5］McGee MC，Hamner JB，Williams RF，et al.Improved intratumoral oxygenation through vascular normalization increases glioma sensitivity to ionizing radiation［J］.International Journal of Radiation Oncology Biology Physics，2010，76（5）：1537-1545.

［6］仲召阳，王东，卿毅李，等.贝伐单抗抑制骨肉瘤血管生成及与放疗的协同作用研究［J］.解放军医学杂志，2009，34（6）：733-736.

［7］Crane CH，Eng C，Feig BW，et al.PhaseⅡtrial of neoadjuvantbevacizumab，capecitabine，andradiotherapyforlocally advanced rectal cancer［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2010，76（3）：824-830.

［8］Liu YE，Lin Q，Meng FJ，et al.High-dose accelerated hypofractionated three-dimensional conformal radiotherapy（at3Gy/fraction）withconcurrentvinorelbine and carboplatin chemotherapy in locally advanced non-small-cell lung cancer：a feasibility study［J］.Radiat Oncol，2013，8：198.

［9］Pavlidis ET，Pavlidis TE.Role of bevacizumab in colorectal cancer growth and its adverse effects：a review［J］. World J Gastroenterol，2013，19（31）：5051-5060.

［10］王海兰，詹正宇，冯苗，等.贝伐单抗治疗高级别脑胶质瘤的研究进展［J］.中国肿瘤临床，2013，40（16）：1001-1004.

［11］Ma X，Yao Y，Yuan D，et al.Recombinant human endostatin endostar suppresses angiogenesis and lymphangiogenesis of malignant pleural effusion in mice［J］.PLoS One，2012，7（12）：e53449.

［12］Hoang T，Huang S，Armstrong E，et al.Enhancement of radiation response with bevacizumab［J］.Journal of Experimental&Clinical Cancer Research，2012，31（1）：37.

［13］Ou G，Itasaka S，Zeng L，et al.Usefulness of HIF-1 imagingfor determining optimal timing of combining bevacizumab and radiotherapy［J］.International Journal of Radiation Oncology Biology Physics，2009，75（2）：463-467.

［14］Zhou S，Gu LB，He J，et al.MDM2 regulates vascular endothelial growth factor mrna stabilization in hypoxia［J］. Mol Cell Biol，2011，31（24）：4928-4937.

［15］Kim YJ，Lee HJ，Kim TM，et al.Overcoming evasive resistance from vascular endothelial growth factor a inhibition in sarcomas by genetic［J］.Int J Cancer，2013，132（1）：29-41.

［16］Goel S，Duda DG，Xu L，et al.Normalizion of the vasculature for treatment of cancer and other diseases［J］.Physiol Rev，2011，91（3）：1071-1121.

Effect of Bevacizumab combined with radiotherapy on lung cancer xenografts in nude mice

YANG QiuxiangZHANG HuanhuanYUAN TaizeLIANG YingYU JinxiuWANG WenjinZHANG Xiuping
Department of Radiotherapy，the Affiliated Cancer Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong Provicne，Guangzhou510095，China

Objective To explore the effect of Bevacizumab combined with radiotherapy on lung cancer xenografts in nude mice.Methods The human lung cancer A549 cells were injected sc into the hind legs of nude mice.When the volume of tumor was about 100-200 mm3after 10 days，nude mice were randomly divided into four groups:control group（injected with saline solution），Bevacizumab group（treated with Bevacizumab 10 mg/kg，once a week，for three times），radiotherapy group（5 Gy/fraction，twice）and Bevacizumab in combination with radiotherapy group（treated with Bevacizumab and radiotherapy）.The tumor size and weight were measured during the treatment.The mice were sacrificed after 41 days.The tumor tissues were collected.The expression of microvessel density（MVD）and vascular endothelial growth factor（VEGF）were detected in histologic sections of xenografts by immunohistochemistry and analyzed by statistical method.Results The subcutaneous xenografts in Bevacizumab in combination with radiotherapy group were decreased significantly as compared with control group（P＜0.05）.The tumor inhibition rate was 82.8%.Immunohistochemistry revealed that Bevacizumab in combination with radiotherapy group could remarkably reduce the MVD and the expression of VEGF［（7.37±4.11），（3.10±0.98）］as compared with the control group［（14.40±5.01），（6.00±1.90）］（P＜0.05）.Conclusion Bevacizumab enhances the radiosensitivity of non-small cell lung cancer by the inhibition of VEGF expression.

Bevacizumab；Radiotherapy；Xenograft；Lung cancer

R734.2

A

1673-7210（2015）05（b）-0018-04

2015-01-13本文编辑：张瑜杰）

吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金项目（320.6750.12682）。

阳秋香（1987-），女，广州医科大学2012级在读硕士研究生；研究方向：肿瘤放射治疗。

张秀萍（1962-），女，博士，硕士研究生导师；研究方向：肿瘤放射治疗。