超声辅助酶解鹰嘴豆蛋白制备抗氧化肽的研究

李芳，侯伟伟，任海波，张文，马欣，孔令明，*

（1.新疆轻工职业技术学院，新疆乌鲁木齐830021；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052）

超声辅助酶解鹰嘴豆蛋白制备抗氧化肽的研究

李芳1，侯伟伟2，任海波1，张文2，马欣2，孔令明2，*

（1.新疆轻工职业技术学院，新疆乌鲁木齐830021；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052）

本文利用超声波辅助酶解鹰嘴豆蛋白粉制备抗氧化多肽，采用响应面分析法考察了超声功率、超声温度和超声时间对酶解产物的超氧阴离子清除率、羟基自由基清除率和还原能力的影响。结果表明，最优的超声酶解条件为：超声功率200 W、超声温度40℃、超声时间28 min，在此条件下，酶解产物对超氧阴离子的清除率、对羟基自由基的清除率和还原能力分别为80.4%、9.2%和71.8%，实际的清除率分别为81.6%、9.4%和72.9%。在相同的浓度下，鹰嘴豆多肽对超氧阴离子的清除率、对羟基自由基清除率和还原能力占维生素C百分比较未经超声波处理的分别提高了4.0%、1.2%和7.8%。

超声波；鹰嘴豆；酶解；多肽；抗氧化活性；响应面分析法

鹰嘴豆（chickpea）属豆科鹰嘴豆属，又名桃尔豆、鸡豌豆、鸡头豆，维吾尔语称“诺胡提”，因其豆粒形状似鹰头而得名。鹰嘴豆富含优质蛋白，干籽粒中蛋白质含量为15%～30%，其氨基酸含量丰富，每100 g蛋白质含有氨基酸约80%～90%，且18种氨基酸种类齐全，8种必需氨基酸的组成均衡，约为33.6%～41.2%，其中赖氨酸含量相对较高［1］。鹰嘴豆蛋白因其氨基酸组成均衡、生物利用率高和抗营养因子低而被作为植物蛋白的重要来源［2］，具有很好的开发利用价值。科学研究表明，将蛋白质酶解可得到许多具多种生物活性的肽，它们具有的生物活性作用包括抗氧化作用、抗高血压、抗病毒、免疫调节、激素调节等［3］。研究表明，酶解鹰嘴豆蛋白获得的鹰嘴豆多肽具有一定的抗氧化活性［4］。

本文采用超声波对鹰嘴豆蛋白质进行辅助酶解，就鹰嘴豆蛋白超声波辅助酶解工艺进行了优化，为鹰嘴豆蛋白资源的开发利用和精深加工提供实验依据和技术参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1原料与试剂

鹰嘴豆蛋白粉：实验室自制；木瓜蛋白酶（80万U/ g）：为南宁庞博生物工程有限公司提供；其余试剂均为分析纯。

1.1.2仪器

HH-S型数显恒温水浴锅：常州市国立实验设备研究所；KQ-250DE型数控超声波洗涤器：上海精密科学技术仪器厂；TD5A-WS型离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；85-2A恒温磁力搅拌器：常州市国立试验设备研究所；DEITA320型手持式pH计：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；PL202型电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；TU-1810型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；BYK型真空冷冻干燥机：北京博爱康实验仪器有限公司等。

1.2方法

1.2.1鹰嘴豆蛋白酶解工艺

鹰嘴豆蛋白粉→加水→调pH→加酶→超声波辅助酶解→高温灭酶→冷却→离心→取上清液→干燥→鹰嘴豆多肽

1.2.2超氧阴离子清除率的测定

采用邻苯三酚方法［5］。

1.2.3羟基自由基清除率的测定

采用邻二氮菲-Fe2+氧化法［6-7］。

1.2.4还原能力的测定［8］

1.2.5响应面优化试验

基于单因素试验结果，根据Box-Benhnken的中心组合设计试验原理建立数学模型，以超氧阴离子清除率、羟基自由基清除率及还原能力为响应值，选择超声功率（X1）、超声处理温度（X2）、超声处理时间（X3）这三个因素的三个较优水平进行响应面试验，试验因素水平见表1。通过响应面曲面分析优化鹰嘴豆抗氧化多肽的制备工艺。

表1　试验因素水平表Table 1Factors and levels of test

2　结果与分析

2.1响应面优化超声酶解条件试验结果

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken响应曲面方法的要求，展开17组试验，鹰嘴豆多肽的超氧阴离子清除率、羟基自由基清除率及还原能力测定结果见表2。

表2　试验方案和结果Table 2Test design and results

采用Design Expert软件，以超声功率、超声处理温度和超声处理时间为响应变量，以超氧阴离子清除率、羟基自由基清除率及还原能力为响应值对表2进行回归分析，所得到的预测模型如下：

进行鹰嘴豆多肽超氧阴离子清除率回归方程的方差分析，结果如表3所示。

进行鹰嘴豆多肽羟基自由基清除率回归方程的方差分析，结果如表4所示。

表3　超氧阴离子清除率的方差分析表Table 3Variance analysis of superoxide anion radical scavenging rate experiment

表4　羟基自由基清除率的方差分析表Table 4Variance analysis of hydroxyl radical scavenging rate experiment

进行鹰嘴豆多肽还原能力回归方程的方差分析，结果如表5所示。

由表3、表4和表5可知，回归方程Y1、Y2和Y3分别为显著、极显著和高度显著，且失拟检验均不显著，说明回归模型的拟合度良好。因此，可以用回归方程替代真实试验对不同超声辅助酶解条件下鹰嘴豆多肽的超氧阴离子清除率、羟基自由基清除率及还原能力进行预测。

由表3可以看出，超声功率（X1）、超声处理温度（X2）和超声处理时间（X3）3个因素中二次项X32对超氧阴离子清除率的影响高度显著，而其余一次项、二次项和交互项对超氧阴离子清除率的影响均不显著。由表4可知，Y2回归方程的一次项X2和X3对羟基自由基清除率的影响分别为高度显著和显著，二次项X12、X22对羟基自由基清除率的影响极显著，而交互项对羟基自由基清除率的影响均不显著。由表5可知，Y3回归方程的一次项X1、X3对还原能力的影响分别为显著和高度显著，二次项X12、X22对还原能力的影响分别为显著和高度显著，交互项X2X3对还原能力的影响为高度显著。

表5　还原能力的方差分析表Table 5Variance analysis of reducibility power experiment

考虑到鹰嘴豆多肽对超氧阴离子、羟基自由基清除能力及还原能力的综合影响，采用响应面软件分析所得的最优超声辅助酶解条件为：超声功率200 W、超声温度40℃、超声时间28 min。在此条件下鹰嘴豆多肽对超氧阴离子的清除率为80.4%，对羟基自由基的清除率为9.2%，鹰嘴豆多肽的还原能力为71.8%。经实验验证，在此条件下鹰嘴豆蛋白抗氧化活性肽对超氧阴离子和羟基自由基的清除率分别为81.6%和9.4%，其还原能力为72.9%。与预测值的相对误差在1.5%左右，证明利用响应面分析法得到的超声辅助酶解条件是可靠的，表明在实践中应用此模型进行预测具有一定的价值。响应面优化结果见图1。

2.2鹰嘴豆多肽与抗氧化剂维生素C的抗氧化活性比较

在响应面优化得到的最优超声辅助酶解条件下制备鹰嘴豆多肽酶解液，分别将该鹰嘴豆多肽酶解液对超氧阴离子的清除率、对羟基自由基的清除率及还原能力与同浓度维生素C具有的抗氧化活性比较，结果见图2和图3。

图1　响应面优化结果Fig.1Results of response surface optimization

图2　自由基清除能力的比较Fig.2Comparison of radical scavenging power

图3　还原能力的比较Fig.3Comparison of reducibility power

由图2可知，鹰嘴豆多肽与维生素C均具有较高的超氧阴离子的清除能力，其超氧阴离子清除率达到了同浓度维生素C的87.2%，而其对羟基自由基的清除能力较低。从图3可知，鹰嘴豆多肽和维生素C均有一定的还原能力，同浓度下鹰嘴豆多肽的还原能力为维生素C的82.3%。

3　结论

研究中采用超声波辅助酶解鹰嘴豆蛋白粉，通过响应面分析，以鹰嘴豆多肽的超氧阴离子清除率、羟基自由基清除率及还原能力作为响应值，优化了超声辅助酶解鹰嘴豆蛋白制备鹰嘴豆抗氧化活性肽的工艺。经优化确定的最优超声波辅助酶解条件为：超声功率200 W、超声温度40℃、超声时间28 min，在此条件下鹰嘴豆蛋白抗氧化活性肽对超氧阴离子的清除率为81.6%，对羟基自由基的清除率为9.4%，其还原能力为72.9%。在相同浓度下，鹰嘴豆多肽对超氧阴离子的清除率占维生素C的百分比较未经超声波处理的相比提高了4.0%；对羟基自由基的清除率占维生素C的百分比较未经超声波处理的相比提高了1.2%；其还原能力占维生素C的百分比较未经超声波处理的相比提高了7.8%。可见超声波辅助水解鹰嘴豆蛋白可显著地对鹰嘴豆蛋白进行破壁，有利于蛋白酶的水解作用，在其余酶解条件均相同的情况下，有效地提高了鹰嘴豆多肽的抗氧化能力。

［1］张涛，江波，王璋.鹰嘴豆营养价值及其应用［J］.粮食与油脂，2004（7）：18-20

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Study on Ultrasonic-assisted Enzymatic Hydrolysis of Chickpea Protein to Prepare Anti-oxidative Peptide

LI Fang1，HOU Wei-wei2，REN Hai-bo1，ZHANG Wen2，MA Xin2，KONG Ling-ming2，*
（1.Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi 830021，Xinjiang，China；2.College of Food and Pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China）

In this paper，ultrasonic-assisted technology was used to hydrolyze chickpea protein powder for preparing anti-oxidative polypeptide.Response surface methodology was applied to study the effects of ultrasonic power，temperature and time on the superoxide anion radical scavenging rate，hydroxyl radical scavenging rate and reducibility of enzymolysis product.The result showed that optimum conditions were as follows：ultrasonic power 200 W，ultrasonic temperature 40℃，ultrasonic time 28 min.Under these conditions，the scavenging rate of superoxide anion radical and hydroxyl radical of chickpea polypeptide was 80.4%and 9.2%respectively，and reducibility of chickpea polypeptide was 71.8%.The actual scavenging rate was 81.6% and 9.4%respectively，and reducibility was 72.9%.At the same concentration，radical scavenging rate and reducibility of chickpea polypeptide and anti-oxidative capacity of vitamin C percentage increased by 4.0%，1.2%and 7.8%.

ultrasound；chickpea；enzymatic hydrolysis；polypeptide；anti-oxidative activity；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.010

2014-10-02

新疆维吾尔族自治区高技术研究发展计划（20131030615）作者简介：李芳（1976—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：农产品加工与综合利用。