蜂胶黄酮与ctDNA的相互作用

刘梁，陈新，周威

（1.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023；2.武汉轻工大学医学技术与护理学院，湖北武汉430023）

蜂胶黄酮与ctDNA的相互作用

刘梁1，陈新1，周威2

（1.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023；2.武汉轻工大学医学技术与护理学院，湖北武汉430023）

研究蜂胶黄酮与ctDNA的相互作用及方式；采用紫外-可见吸收光谱法，通过比较不同浓度ctDNA与蜂胶黄酮化合物反应后的吸光度变化，根据吸收曲线得出黄酮化合物与ctDNA在不同条件下的结合常数；加入ctDNA后蜂胶黄酮的吸光强度明显下降，出现减色效应，不同pH条件下，黄酮和ctDNA的结合常数也不同；蜂胶黄酮可以和ctDNA发生有效结合，结合强度受pH变化的影响。

蜂胶；ctDNA；黄酮；结合

蜂胶被誉为“紫色黄金”，是蜜蜂用从植物嫩芽及树干上采集的树脂并混入自身上颚腺分泌物和蜂蜡混合而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。蜂胶中含40余种不同结构的黄酮化合物。黄酮类化合物有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛、抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤作用。近年来，国内外对黄酮类化合物生理生物活性的研究，随着生物学、生物化学、生理学等的发展而发展，把生理现象的研究迅速推向细胞水平与分子水平，从而揭示了某些黄酮类化合物的作用本质，阐明了其作用原理［1-5］。

DNA是体内重要的遗传物质，决定着生物体的生长、繁殖、遗传、变异和转化等生命过程。DNA作为一种重要的细胞受体，尤其DNA与小分子相互作用的机理，是目前生命科学、化学和临床医学中共同关注和感兴趣的课题，近年来，由于医药学和生命科学的发展，研究小分子与DNA的相互作用机理过程，对药代动力学的认识和开发新药有极其重要的意义。许多药物是通过与DNA结合来改变DNA的复制，从而抑制细胞的生长，这是设计新的更加有效的药物的基础。药物的活性决定于它们与DNA的结合方式和它们之间的亲和力。在研究药物小分子与DNA的相互作用方式上，众多学者做了许多研究。在药物小分子与DNA的相互作用上，存在不同的结合方式。目前，比较常见的方法是采用溴化乙锭作为荧光探针对小分子与DNA的作用进行研究［6-8］。

黄酮类化合物对DNA分子氧化损伤有保护作用，而黄酮化合物与DNA分子发生相互作用是其具有以上活性的关键因素。小分子化合物与DNA相互作用的作用方式有：（1）小分子与DNA之间的氢键作用；（2）小分子与DNA分子间的静电作用；（3）插入作用［9-11］。本文以从蜂胶中分离得到的3个黄酮化合物为研究对象，分子结构如图1所示，通过紫外-可见分光光度法考察它们与ctDNA的相互作用，为蜂胶产品开发提供理论参考。

1材料与方法

1.1材料与设备

黄酮化合物，由武汉轻工大学医学与护理学院周威老师提供；小牛胸腺DNA（ctDNA），北京华美生物工程有限公司产品，用0.05 mol/mL的NaCl溶液配置成0.5 mol/mL的储备液，处理好的ctDNA溶液放于4℃的冰箱中保存，测量ctDNA在260 nm处的吸光度，DNA的浓度由吸光值A260和摩尔消光系数A=ε·c·L确定，则ctDNA浓度为8.2×10-4mol/L。lambda 25紫外可见分光光度计（美国PE公司）；pH为3.0、5.0、5.8、7.4、8.4的缓冲溶液，所用溶剂为双蒸水。

图1　蜂胶中黄酮化合物（1）-（3）分子结构Fig.1The molecular structures of propolis flavonoids（1）-（3）

1.2方法

1）在5 mL离心管中，分别加入50 mL的黄酮化合物，后加入500 μL相同pH的缓冲液，再依次加入2、5、10、15、20、30、50 μL的DNA，用双蒸水定容至2.5 mL，摇匀。以不加DNA的黄酮化合物溶液做空白，加入比色皿中用紫外可见分光光度计测复合物吸收曲线的变化。

2）在5 mL离心管中，分别加入等量的黄酮化合物和ctDNA，后加入500 μL不同pH的缓冲液，用双蒸水定容至2.5 mL，摇匀。以不加ctDNA的黄酮化合物溶液做对照样品，加入比色皿中测定各个样品中复合物的吸收曲线。

2结果与分析

黄酮化合物具有一组或多组稠芳环，它们在一定浓度时可能通过π-π堆积而形成二聚或多聚，所以我们应用吸收光谱滴定进行观察。在紫外光谱仪中，向参比池中加入一定的缓冲溶液，在样品池中加入一定体积的样品溶液，不断增加样品的浓度直到饱和，样品的吸收光谱不变。紫外可见吸收光谱吸收法是研究小分子与DNA相互作用机理的最常见、最方便的方法之一［9］。当小分子与DNA结合后，其电子结构会受到DNA的扰动，导致小分子所处的环境发生变化，小分子与DNA结合的强弱［10］可通过光谱变化的幅度反应出来。一般情况下，当小分子以嵌入模式与DNA作用时，其吸收光谱会出现一定的峰位红移效应。这是因为插入的小分子与DNA的碱基对发生π电子堆积后，使其π星空轨道与π电子轨道发生偶合，能级下降，从而产生红移现象，同时，偶合后的π轨道因部分填充电子，跃迁几率减少，产生红移现象［11］。为了定量的比较化合物与DNA结合的强弱，我们通过化合物光谱滴定实验，以最大波长峰吸光度的变化，按照下列方程式［10］计算了化合物与DNA的结合常数Kb。［ctDNA］/（εa-εf）=［ctDNA］/（εb-εf）+1/Ka（εb-εf）式中：［DNA］表示DNA浓度；εa为共存溶液中化合物的表观摩尔吸光系数；εf为未加入ctDNA的化合物的摩尔吸光系数；εb为化合物与ctDNA键合饱和的结合物的表观摩尔吸光系数。以［DNA］/（εa-εf）对［DNA］作图，斜率与截距的比值为结合常数Kb。

表1　不同pH条件下黄酮化合物与ctDNA的结合常数KbTable 1Kbof ctDNA and flavonoidscompounds at different pH

化合物（1）-（3）的紫外-可见吸收光谱图如图2～图4所示。

图2　化合物（1）紫外-可见吸收光谱Fig.2The UV-vis absorption spectroscopy of compound（1）

图3　化合物（2）紫外-可见吸收光谱Fig.3The UV-vis absorption spectroscopy of compound（2）

图4　化合物（3）紫外-可见吸收光谱Fig.4The UV-vis absorption spectroscopy of compound（3）

黄酮化合物与ctDNA相互作用后，黄酮化合物的紫外-可见吸收光谱的最大吸收出现减色效应，但并未有红移效应出现，说明黄酮化合物不是通过嵌入方式与ctDNA结合。在不同的pH条件下，二者的结合常数有显著差异，在pH为3.0时，黄酮化合物与ctDNA的结合常数最大，这是由于黄酮分子中羟基发生质子效应从而带正电荷后，与带负电荷的DNA分子通过静电作用结合。此外，从分子结构上分析可知，在相同条件下分子中所含羟基个数越多，其与DNA的结合常数值越大，即羟基数目：（2）＞（3）＞（1），与DNA的结合常数显示（2）＞（3）＞（1）的规律，这进一步验证了蜂胶黄酮与ctDNA分子通过静电作用方式相互结合。

3结论

实验发现蜂胶黄酮化合物（1）-（3）可以与ctDNA相互结合，结合强度受分子中羟基数目及反应pH条件的影响，相同pH条件下化合物（2）与ctDNA的结合常数最大，酸性条件下，蜂胶黄酮与DNA结合作用最强。不同化合物之间，结合强度（2）＞（3）＞（1），不同pH条件下，结合常数pH3.0＞pH5.0＞pH5.8＞pH7.4＞pH8.4。

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Interaction of Propolis Flavonoids and CTDNA

LIU Liang1，CHEN Xin1，ZHOU Wei2
（1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China；2.School of Health Science and Nursing，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

Explore the interaction and mode between propolis flavonoids and ctDNA.Through the UV-visible absorption spectroscopy measure，comparing the absorbance intensity changes of flavonoids after react with different concentrations ctDNA to analysis the binding constant between propolis and ctDNA.The absorption intensity of propolis decreased when add ctDNA in the sample.The binding constants of flavonoids and ctDNA were also different in different pH conditions.There was an interaction between propolis flavonoids and the binding strength was depend on pH condition.

propolis；ctDNA；flavone；combination

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.006

2015-01-27

刘梁（1981—），男（汉），讲师，博士，研究方向：食品活性成分研究。