二次旋转正交设计优化鹰嘴豆蛋白酶解工艺的研究

张继贤，程卫东，田洪磊，詹 萍

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

二次旋转正交设计优化鹰嘴豆蛋白酶解工艺的研究

张继贤，程卫东，田洪磊*，詹 萍

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

实验选用碱性蛋白酶（Alcalase）和风味蛋白酶（Flavourzyme）分步依次酶解鹰嘴豆蛋白，采用二次旋转正交组合实验设计对其酶解工艺进行优化。结果显示，在初始pH8.5，初始温度55℃，鹰嘴豆蛋白酶解的最佳工艺条件为：底物浓度1%，碱性蛋白酶的添加量为2000U/g，作用时间为2.5h，风味蛋白酶的添加量为4000U/g，作用时间为3h。在此条件下，其最大水解度可达29.17%。

二次旋转正交组合实验设计，鹰嘴豆，酶解

鹰嘴豆（Cicer arietium L.），一年生或多年生草本植物，适合在半干旱亚热带区域生长，据统计，鹰嘴豆是世界上的第二大消费豆类，其产量位居世界第三，是世界上栽培面积较大的食用豆类作物之一［1］。在我国新疆、甘肃、河北、山西等地均有栽培，其中以新疆鹰嘴豆种植面积最大、产量最高、质量最好而著称［2］。

在新疆维吾尔族地区，由于鹰嘴豆具有诸如强壮筋骨、健胃消脾、滋润养颜、抗HIV、抗骨质疏松等多种药用功效，人们普遍将其视为一种营养价值较高的滋补品［3］。此外，由于鹰嘴豆蛋白的氨基酸组成均衡、生物利用率高、抗营养因子低等，同时也被视为较为重要的植物蛋白资源。目前，国内外对鹰嘴豆蛋白进行了大量的研究，主要集中在鹰嘴豆蛋白的分离纯化、营养价值、功能特性等方面［4-6］。薛朝辉等［7］对鹰嘴豆蛋白进行了分类研究，发现鹰嘴豆蛋白具有较强的抗氧化活性，球蛋白活性更强，值得进一步研究。张涛等［8］对鹰嘴豆的分离特性进行了研究，发现用碱溶酸沉法提取的鹰嘴豆蛋白的纯度高达91.53%，在两个特殊点pH 5.0和离子强度0.2时，其溶解性和乳化能力都最小。马文鹏等［9］利用碱性蛋白酶进行酶解，采用响应面法优化酶解工艺，酶解所得的水解度仅为16.18%。然而对鹰嘴豆进行双酶酶解的研究及其酶解液进一步开发利用，目前研究相对较少。本文利用碱性蛋白酶和风味蛋白酶对鹰嘴豆蛋白进行酶解，以水解度（DH%）为指标，采用二次旋转正交组合实验设计优化鹰嘴豆蛋白的双酶酶解工艺，以期最大限度提高鹰嘴豆蛋白的利用率，为鹰嘴豆蛋白的开发利用在理论上提供依据，并为后期对鹰嘴豆蛋白的深加工提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鹰嘴豆 购自新疆石河子农贸市场，用高速粉碎机将其粉碎，过80目筛，收集后以石油醚：鹰嘴豆粉2∶1（v/m）的比例，在摇床中振荡2h，按此重复操作3次，弃去有机溶剂，进行脱脂，将脱脂后的鹰嘴豆粉置于通风厨中干燥12h，将处理好的鹰嘴豆粉装于中型广口瓶中置于4℃的冰箱中，保存备用［10］；碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 诺维信（中国）生物技术有限公司；其他实验试剂 均为国产分析级。

DFT-100手提式高速粉碎机 温岭市林大机械有限公司；DK-8D数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；PHS-3C雷磁pH计 上海精科；Neofuge 15R台式高速冷冻离心机 力康发展有限公司；ZHWY-111B落地普通型大容器恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；Ultrospec 5300 pro紫外可见分光光度计 上海市浦东张江高科技园区。

1.2 蛋白酶的筛选

准确称取鹰嘴豆粉2.0g，加入蒸馏水100m L，选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶在各自最适温度和pH条件下，酶解2h，酶解完成后，在90～95℃条件下灭酶10min，冷却至室温，离心取其上清液，测定酶解产物的水解度和可溶性氮含量，确定最佳用酶。各种蛋白酶的酶解条件如表1所示。

表1 四种蛋白酶的酶解条件Table 1 The hydrolysis conditions of four protease

1.3 单因素实验

1.3.1 碱性蛋白酶底物浓度 保持碱性蛋白酶的最适温度和pH，加酶量3000U/g，反应时间2h，设底物浓度（鹰嘴豆蛋白）0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%五个水平，考察可溶性氮含量和水解度的变化趋势。

1.3.2 碱性蛋白酶的添加量 在碱性蛋白酶最适的温度和pH条件下，底物浓度2.0%，反应时间2h，设酶的添加量1000、1500、2000、2500、3000U/g五个水平，考察可溶性氮含量和水解度的变化趋势。

1.3.3 碱性蛋白酶的反应时间 以碱性蛋白酶的最适温度和pH为前提，底物浓度2.0%，酶的添加量3000U/g，设置时间变量1、2、3、4、5h五个水平，分别考察可溶性氮含量和水解度的变化趋势。

1.3.4 风味蛋白酶的添加量 在风味蛋白酶的最适温度和pH的条件下，底物浓度2.0%，反应时间2h，酶的添加量1000、1500、2000、2500、3000、3500U/g六个水平，考察可溶性氮和水解度的变化趋势。

1.3.5 风味蛋白酶的反应时间 风味蛋白酶的最适温度和pH条件下，底物浓度2.0%，酶的添加量3000U/g，设反应时间0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h五个水平，考察可溶性氮含量和水解度的变化趋势。

1.4 二次旋转正交实验设计优化酶解条件

以单因素实验为基础，初始温度55℃，初始pH 8.5，采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶依次分步进行酶解，以水解度为指标，分别以碱性蛋白酶的添加量和作用时间、风味蛋白酶的添加量和作用时间、底物浓度为变量进行五因素二次旋转组合实验设计（1/2实施），共进行36组实验，每组实验均进行3组平行实验进行分析验证。因素水平编码见表2。

表2 二次旋转回归正交组合实验设计因素水平编码表Table 2 The factors and levels of quadratic regression orthogonal rotation design

1.5 鹰嘴豆酶解工艺的流程

鹰嘴豆粉→加入适量蒸馏水→灭酶（90℃，10～15min）→用3mol/L NaOH调节pH至8.5→加入碱性蛋白酶进行酶解（55℃）→加入风味蛋白酶进行酶解（50℃）→灭酶（90℃，10～15min）→离心，取上清液。

1.6 测定指标及方法

可溶性氮含量：酶解产物上清液中总氮量与原料中总氮含量的百分比，采用微量凯氏定氮法；甲醛电位滴定法：水解度DH（%）［11］=水解液中总游离氨基酸含氮量/总氮量×100；蛋白质［12］：微量凯氏定氮法；脂肪［12］：索氏抽提法；总糖［12］：直接滴定法；水分［12］：常压干燥法。

1.7 数据统计分析

数据采用Origin 8.0和DPS 7.05数据处理软件进行分析处理，每组实验的数据均进行三次平行实验进行验证。

2 数据处理与分析

2.1 鹰嘴豆粉成分分析

对鹰嘴豆的主要组成成分进行分析，结果如表3所示。由表3可以看出，鹰嘴豆中的蛋白质含量高达23.59%，蛋白质含量比较丰富，可利用的蛋白质较多，符合实验用样品的要求。

2.2 蛋白酶的筛选

根据各种蛋白酶对蛋白质酶切位点的不同，分别选取碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶四种蛋白酶，在添加相同酶活添加量（2000U/g）及其最适pH和温度条件下对鹰嘴豆进行酶解，以DH（%）和可溶性氮含量为指标［13］，考察不同蛋白酶对鹰嘴豆蛋白酶解效果的影响，结果见图1。

表3 鹰嘴豆粉的基本营养成分Table 3 Basic nutrition components in Chickpea flour

图1 不同蛋白酶对鹰嘴豆粉酶解效果的影响Fig.1 Effect of different protease on enzymatic hydrolysis of Chickpea protein

由图1可以看出，四种蛋白酶对鹰嘴豆酶解效果差异显著（p＜0.05）。风味蛋白酶的酶解效果最好，水解度可达22.05%，其次依次为碱性蛋白酶（16.25%）、木瓜蛋白酶酶（12.77%）和中性蛋白酶（11.59%）。酶解液中可溶性氮含量的变化与相应酶酶解水解度变化趋势大致相同，可溶性氮回收率均在53.3%～75.67%。这主要是由于不同蛋白酶对底物的酶切位点不同，所产生的酶解物中游离氨基酸种类和肽段的分子量存在较大差异，导致水解度呈现出较大的区别。本研究的目的是最大程度的利用鹰嘴豆的蛋白质资源，由于单一酶对底物的作用范围有限，故本实验拟采用不同性质、对鹰嘴豆蛋白有着不同切割位点的两种酶进行双酶酶解，以最大程度提高鹰嘴豆蛋白的水解度。前人研究发现，碱性蛋白酶酶解完成后，pH基本稳定在6.8～7.2范围内，与风味蛋白酶的最佳酶解pH基本吻合［13］，避免了后续利用金属盐或缓冲溶液调节pH给产品开发带来的安全隐患问题。因此，本实验选用碱性蛋白酶和风味蛋白酶对鹰嘴豆粉进行双酶酶解。

2.3 酶解单因素实验

2.3.1 碱性蛋白酶对不同浓度的鹰嘴豆蛋白的酶解效果 在不同的底物浓度下，碱性蛋白酶对鹰嘴豆蛋白酶解水解度和可溶性氮含量的测定结果如图2所示。

由图2可知，不同底物浓度对鹰嘴豆蛋白水解度的影响存在显著差异（p＜0.05）。随着底物浓度的升高，水解度呈现先增高后降低的趋势，当底物浓度为2%时达到最大值。当底物浓度再增加，水解度下降，这是由于底物浓度过高时，酶与底物接触不充分［14］，不利于酶解反应的进行。底物浓度过低时，水解度过低，不利于后续产品的开发［15］。可溶性氮含量存在的显著差异（p＜0.05），当底物浓度为1%时，可溶性氮含量较高，可能生成了许多小肽。因此，碱性蛋白酶对鹰嘴豆粉酶解的最佳底物浓度为1%～2%。

图2 不同碱性蛋白酶底物浓度对酶解效果的影响Fig.2 Effect of substrate concentration on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

2.3.2 碱性蛋白酶添加量对鹰嘴豆酶解效果的影响

碱性蛋白酶不同添加量对鹰嘴豆蛋白酶解效果的影响，如图3所示。

图3 碱性蛋白酶加酶量对鹰嘴豆酶解效果影响Fig.3 Effect of amounts of enzyme on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

由图3可以看出，随着酶的添加量不断增加，水解度和可溶性氮含量均有递增的趋势，当增加到1500～2500U/g时，水解度呈现平缓趋势，差异不明显；当添加量增加到3000U/g时，水解度又有所提升，但是可溶性氮含量则呈现明显下降趋势。综合考虑到成本和后续反应的进行，将碱性蛋白酶的添加量确定为1500～2500U/g。

2.3.3 碱性蛋白酶的作用时间对酶解效果的影响 碱性蛋白酶不同酶解时间对鹰嘴豆蛋白酶解效果的影响，如图4所示。

通过图4可知，随着酶解时间的增加，水解度和可溶性氮含量开始均呈现上升的趋势，不同的是，当酶解至2h之后，水解度基本处于平稳状态，而可溶性氮含量在酶解3h之后，有下降的趋势。综合考虑水解度和可溶性氮含量两个指标，最佳的酶解时间应该选择2～3h。

图4 酶解时间对鹰嘴豆粉酶解效果的影响Fig.4 Effect of time on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

2.3.4 风味蛋白酶的添加量对酶解效果的影响 风味蛋白酶的不同添加量对鹰嘴豆蛋白酶解效果的影响，结果如图5所示。

图5 风味蛋白酶的添加量对鹰嘴豆粉酶解效果的影响Fig.5 Effect of amounts of enzyme on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

由图5可知，当风味蛋白酶不断增加时，水解度呈现先增加后减小的趋势，当加酶量为3000U/g时，水解度达到最大值为18.57%。虽然当加酶量达到3000U/g时，可溶性氮含量仍然处于上升的趋势，但这时的酶解液中可能含有大量的寡肽和氨基酸，产生了一些苦味肽，不利于后续利用酶解液进行美拉德反应。因此综合考虑，确定3000U/g为风味蛋白酶的最佳添加量。

2.3.5 风味蛋白酶酶解时间对酶解效果的影响 风味蛋白酶的不同酶解时间对鹰嘴豆蛋白酶解效果的影响，结果如图6所示。

由图6可以看出，随着时间的增加，水解度和可溶性氮含量均呈现先下降后上升再下降的趋势。当酶解时间为2h时，水解度和可溶性氮含量均达到了最大值，分别为13.93%和66.42%。所以通过两个指标的变化趋势，初步确定风味蛋白酶酶解鹰嘴豆蛋白较佳酶解时间为2h。

2.4 二次旋转正交组合实验设计结果分析

2.4.1 二次旋转正交组合回归方程的建立 在单因素实验的基础上，采用五因素二次旋转正交组合实验设计（1/2实施），实验设计结果和方差分析见表4～表6。

图6 风味蛋白酶的酶解时间对鹰嘴豆粉酶解效果的影响Fig.6 Effect of time on enzymatic hydrolysis of Chickpea flour

表4 二次旋转正交组合实验设计实验结果Table 4 The results of Quadratic regression orthogonal rotation design

表5 回归系数方差检验表Table 5 Regression coefficientof variance test results

表6 方差分析Table 6 The square－difference analysis

由表6方差分析结果可知，回归方程的失拟性检验p=0.235＞0.05不显著，从而可以认为方程合理，所选的回归模型是适当的；回归显著性检验p=0.0001＜0.01极其显著，说明建立的回归模型与现实情况吻合的较好，模型成立［16］。

对回归系数的显著性检验，以下是α=0.05显著水平剔除不显著项后，化简后的回归方程：

经计算数学模型的相关系数R2=0.9334，说明在酶解实验中的各种酶解条件下，对水解度的影响93.34%的可变性可以用此数学模型来解释。

2.4.2 二次回归模型单因子效应分析 采用降维分析法［17］，得出单因子变化时对水解度的影响，结果如图7所示。

图7 单因子效应Fig.7 The relationship of single factors to hydrolysis degree

由图7可看出，碱性蛋白酶的添加量在-2～+2的水平上水解度先升高后降低；碱性蛋白酶的作用时间在-2～+2的水平上，先下降后升高；风味蛋白酶的添加量和酶解时间在-2～+2的水平上，水解度均呈现递增的趋势；而底物浓度在-2～+2的水平上，水解度呈现先降低后略微增加的趋势。单因子的变化趋势，与单因素实验的变化趋势进本吻合，说明本实验采用二次旋转正交组合实验设计是合理的。

2.4.3 二次回归模型交互作用效应分析 对上述回归模型中具有显著性的交互项影响可通过图8（a～g）所示的响应面图反映。

从图8（a）中可以看出，提高碱性蛋白酶的添加量，水解度先呈下降后呈上升的趋势，延长碱性蛋白酶的酶解时间则呈现先上升后下降的趋势，两者的交互作用变现为水解度的提高；（b）增加碱性蛋白酶的量，水解度呈上升的趋势。随着风味蛋白酶酶解时间的增加，水解度呈现上升后又小幅下降的趋势，两者的交互作用变现为水解度的下降；（c）为碱性蛋白酶的酶解时间和风味蛋白酶添加量的交互影响，增加碱性蛋白酶的酶解时间同时减少风味蛋白酶的添加量变现为提高水解度，同时减小碱性蛋白酶的作用时间同时提高风味蛋白酶的添加量也变现为水解度的提高，两者的交互作用变现为水解度的提高；（d）为碱性蛋白酶的酶解时间和风味蛋白酶的作用时间的交互影响，在大部分范围内，增加碱性蛋白酶的酶解时间和增加风味蛋白酶的作用时间，可以增加水解度。但两者交互的影响为鹰嘴豆粉酶解液水解度的降低；（e）为碱性蛋白酶的酶解时间和底物浓度的交互作用，由等高线和响应面可以看出，在大部分范围内同时减小碱性蛋白酶的酶解时间和底物浓度，可以增加水解度。两者的交互作用影响为鹰嘴豆酶解液水解度的减小；（f）风味蛋白酶的添加量和酶解时间的交互作用，随着酶添加量的增加，水解度有增加的趋势，而随着酶解时间的增加，水解度有小幅度下降的趋势。在增加风味蛋白酶的添加量的同时，减小风味蛋白酶的作用时间，可以增大水解度。两者的交互作用影响为水解度的提高；（g）风味蛋白酶的酶解时间和底物浓度的交互作用，随着酶解时间和底物浓度的增加，水解度具有明显下降的趋势。风味蛋白酶的酶解时间和底物浓度的交互影响为水解度的降低。

2.4.4 双酶酶解鹰嘴豆粉最佳条件的确定 用DPS软件对五元二次旋转正交组合实验的结果进行分析优化，最终得出最佳的双酶酶解条件为：碱性蛋白酶酶的添加量为2000U/g，酶解时间为2.5h；风味蛋白酶酶的添加量为4000U/g，酶解时间为3h，碱性蛋白酶的底物浓度为1%，在此条件下对鹰嘴豆粉的水解度可达到29.17%。验证实验所测值为（28.65%）与理论值基本一致，所以该实验的重复性较好。

3 结论

通过二次旋转正交组合实验设计，建立了底物浓度和两种酶的作用时间和酶添加量的回归模型，选择出双酶酶解鹰嘴豆粉的最佳条件为：底物浓度1%，碱性蛋白酶的酶添加量2000U/g，反应时间2.5h；风味蛋白酶的酶添加量4000U/g，反应时间3h，最大水解度可达29.17%，与实验验证值（28.65%）基本一致，实验的重复性良好。

图8 双因子交互作用的影响Fig.8 The interaction effectanalysis of two－factors to hydrolysis degree

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Optimizing enzymatic hydrolysis conditions of Chickpea flour through quadratic orthogonal rotation combination design

ZHANG Ji-xian，CHENG Wei-dong，TIAN Hong-lei*，ZHAN Ping
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi832000，China）

The Chickpea flour was hydrolyzed with Alacalase and Flavourzyme，and the quadratic regression orthogonal rotary combination design was used to improve the op timization of hydrolysis conditions of Chickpea protein.The results showed that when the initial pH was 8.5 and the temperature was 55℃，the best processing conditions of Chickpea protein enzymolysis were as follows:the substrate concentration 1%，the Alcalase dosage 2000U/g with 2.5h，the adding content of flavourzyme was 4000U/g with 3h.Based on these conditions，the maximum deg ree of hydrolysis could reach 29.17%.

quadratic orthogonaldesign；Chickpea flour；enzymolysis

TS255

A

1002-0306（2015）08-0196-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.032

2014－07－07

张继贤（1989－），男，在读硕士研究生，研究方向：食品风味化学。

*通讯作者：田洪磊（1979－），男，博士，副教授，研究方向：功能食品与配料。

兵团兴边富民科技专项（2012BA068）。