星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响实验研究

吕文龙　赵 玉　徐铁军

（1 江苏省连云港中医药高等职业技术学校，江苏 连云港 222007；2 徐州医学院人体解剖学与神经生物学教研室，江苏 徐州 221002）

星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响实验研究

吕文龙1赵 玉2徐铁军2

（1 江苏省连云港中医药高等职业技术学校，江苏 连云港 222007；2 徐州医学院人体解剖学与神经生物学教研室，江苏 徐州 221002）

目的 研究星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响。方法 随机在我院动物实验中心选取3只大鼠为研究对象，将本次实验均分为普通星形胶质细胞的培养的对照组以及星形胶质细胞与神经干细胞互不接触状态下共同培养的实验组。对比两组星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响效果。结果 实验组的纯化星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记为阳性，其细胞纯度高到96%，且在神经元特异性烯醇化酶阳性细胞与酪氨酸羟化酶阳性细胞均比对照组多。结论 星形胶质细胞不仅可以加快神经干细胞向神经元细胞的分化以及向多巴胺神经元细胞的分化，而且可以延长神经元存活时间，降低神经元凋亡率。

星形胶质细胞；神经干细胞分化；疗效

作为可以有效促进人体神经系统发育及成熟的细胞之一，星形胶质细胞主要以其分泌产生的一定的膜关因子以及可溶性因子为诱因，加快中枢神经细胞的成熟及分化［1］。由于我国对此类研究的数量过少，因此就星形胶质细胞对人体神经干细胞分化及存活等方面的研究十分必要。

1　资料与方法

1.1一般资料：实验材料为0～3 d的新生3只大鼠，数量为3只，实验动物中心提供。主要试剂与设备：干粉培养基、B27；bFGF、EGF、PLL；小鼠抗人NestinIg G及NSE 单克隆抗体，兔抗 GFAP 多克隆抗体与IgG -HRP羊抗兔等。 同时，还有胰蛋白酶；小鼠抗 TH 单克隆抗体；病理图像分析仪与气浴恒温振荡床［2］。

1.2方法

1.2.1取材与培养：取新生0～3 d的3只大鼠的脑组织海马，并将其分离放置于平衡盐溶液的培养皿中进行漂洗。在用平衡盐溶液将海马清洗3次后，将其移进无菌小瓶中，剪至适当尺寸的组织块，采用吸管吹打后。在37 ℃下加入6.5倍量左右的2.5%胰蛋白酶，进行消化15 min，待组织块出现变化至疏松且颜色发白时，可将其取出，并用胎牛血清的DMEM/F12培养基停止消化，并进行相关操作将其制成单细胞悬液；然后选取滤网过滤5 min（1000 r/min），去掉上清液后，将20 μg/L表皮生长因子的DMEM/F12培养基和含2%的B27、10μg/L 碱性成纤维生长因子洗涤细胞2次，反复离心去除上清液后，加入适量的培养液，将其制成细胞悬液，活细胞在椎虫蓝染色后进行计数，调整细胞密度，后接种置与25 mL的培养瓶；在饱和湿度下，体积为0.05的CO2培养箱中培养，在初次换液时，采用分瓶法，往后均2.5 d左右后进行1次换液；在培养5～6 d后，将发育长至200 μm的神经干细胞分离细胞克隆球传代（机械分离）。

1.2.2对胶质细胞的原代培养：取出新生3 d的3只大鼠的大脑组织，剪至适当尺寸的组织块在通过0.25%胰蛋白酶，并在消化0.5 h后（37 ℃下）通过400目纱网进行过滤。然后在预先配置好的营养液中将过滤的相关组织打散成悬液状，进而将其接种在玻璃培养皿上。最终进行胶质纤维酸性蛋白标记以及相关纯度鉴定。

1.2.3实验组的细胞培养：实验组是的细胞培养运用胰蛋白酶把培养基上的星形胶质细胞消化为单细胞悬液，再以一定的细胞数量放置于12孔培养板上加进完全培养液进行培养，其培养基上的温度、培养时间以及更换培养基内培养液的间隔时间均必须严格按照要求进行，直到第7天时便可以对盖玻片上培养的细胞进行染色检查。

1.2.4免疫细胞化学染色和细胞计数及统计学分析：对培养基上载玻片上采用免疫细胞化学染色的方法进行研究星形胶质细胞对干细胞分化的影响因素，其具体的操作必须严格按照要求进行实施，并计算染色下细胞阳性的发生率。

1.3统计学方法：使用SPSS19.0统计软件对上述星形胶质细胞对神经干细胞分化的数据进行分析，采用t检验与卡方检验进行相关指标的测试与分析。当P＜0.05时，有统计学意义。

2　结 果

实验组的纯化星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记为阳性，其细胞纯度高到96%，而且在神经元特异性烯醇化酶阳性细胞与酪氨酸羟化酶阳性细胞均比对照组多。见表1。

3　讨 论

表1　两组的临床疗效

作为人体神经系统中数量极多的细胞之一，星形胶质细胞不仅具有提高人体神经系统结构及相关营养的供给，而且具有修复神经组织、促进神经干细胞分化以及神经免疫、促进细胞再生等重要作用［3］。

研究表明，在人体中枢神经细胞中，星形胶质细胞的数量为神经元细胞的30倍左右，且二者相互作用，相互影响。由上述结果可知，将星形胶质细胞与神经干细胞共同培养的实验组较之普通培养的对照组，在细胞接种之后，其细胞球不仅细胞贴壁速度快，而且分化程度差异较大，尤其在培养4 d后。采用光镜进行观察，其细胞的胞体不大、边缘光滑、立体感较强的神经元样细胞，而对照组在这类细胞的数量明显要少、细胞的状态生命力较弱；免疫细胞化学结果显示，共培养组的神经元及多巴胺神经元明显较对照组高，且星形胶质细胞的比例均较对照组低。综上所述，与传统细胞培养与神经干细胞分化相比，采用星形胶质细胞联合神经干细胞共同培养中，星形胶质细胞不仅可以加快神经干细胞向神经元细胞的分化以及向多巴胺神经元细胞的分化，而且可以延长神经元存活时间，降低神经元凋亡率。值得临床神经干细胞分化培养上进一步推广应用。

［1］罗杰峰.黎海燕.沈岳飞.星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11（42）:8515-8519.

［2］庄朋伟.张艳军.庞坦.黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13（1）:43-47.

［3］张志琳.包仕尧.汪立平.鲍欢.星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的实验研究［J］.临床神经病学杂志，2006，19（1）:45-47.

Experimental Study of Astrocyte Differentiation of Neural Stem Cells

LV Wen-Long1，ZHAO Yu2，XU Tie-Jun2
（1 Jiangsu Lianyungang Higher Vocational Technical College of Traditional Chinese Medicine，Lianyungang 222007，China；2 Depamrtent of Human Anatomy and Neurobiology，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002，China）

Objective To study the effects on neural stem cell differentiation astrocytes. Methods Experimental animal center in our hospital three rats were selected for the study，will this experiment were divided into normal astrocytes cultured in the control group as well as astrocytes and neural stem cells do not touch each state experimental group co-cultured. Compared two groups of astrocytes on neural stem cell differentiation effects. Results The purified astrocytes and glial fibrillary acidic protein antibody in the experimental group labeled as positive，its cells to 96% high purity and neuron-specific enolasepositive cells and tyrosine hydroxylase-positive cells were than the control group. Conclusion Astrocytes not only accelerate the differentiation of neural stem cells into neurons and differentiate into dopaminergic neurons，and can prolong the survival time of neurons，reducing neuronal apoptosis.

Astrocytes； Neural stem cell differentiation； Efficacy

R-332

B

1671-8194（2015）18-0019-02