高效液相色谱法同时测定炎热清片中栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素含量

宁科贤，黄燕萍

（1.广西医科大学第一附属医院药学部，广西南宁530021；2.广西壮族自治区北海食品药品检验所，广西北海536000）

高效液相色谱法同时测定炎热清片中栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素含量

宁科贤1，黄燕萍2

（1.广西医科大学第一附属医院药学部，广西南宁530021；2.广西壮族自治区北海食品药品检验所，广西北海536000）

目的建立同时测定炎热清片中栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法采用Eclipse XDB柱（150mm× 4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脱，流速为0.80mL/min，检测波长0～10min为238 nm、10.01～45min为275 nm。结果栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素的质量浓度线性范围分别为4.30～86.10μg/mL（r=0.999 8），4.36～175.00μg/mL（r=1.000 0），1.15～46.10μg/mL（r=0.999 9）。方法回收率均不低于98%。结论该法简便、准确、重现性好，能排除其他成分的干扰，可用于炎热清片的质量控制的评价。

高效液相色谱法；栀子苷；黄芩苷；汉黄芩素；炎热清片

炎热清片由玄参、龙胆、石膏、柴胡、栀子、黄芩、薄荷脑等7味中药组方，具有解表清里、清热解毒功效；临床用于呼吸道炎，如支气管炎、肺炎、急性扁桃体炎，也可用于泌尿系感染、胆道感染［1］。原标准只有黄芩苷的含量测定项，文献［2］报道了测定炎热清片中龙胆苦苷的含量，但同时测定炎热清片栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素3种成分尚未见报道。参考文献［3-10］建立了同时测定炎热清片中栀子、黄芩的主要成分栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素含量的高效液相色谱（HPLC）法，现报道如下。

1　仪器与试药

Agilent1200型高效液相色谱仪，Agilent1200 LC型色谱工作站，G1322A型溶剂脱气机（DEGASSER），G1311A型四元泵（Quat Pump），G1329A型自动进样器（ALS），G1314B VWD型紫外检测器；CP225D型电子天平（德国赛多利斯）；COBOSAW-120型自动电子天平；SB3200WS型超声波清洗器（上海必能信）；Type HT-203A column HEATER（天津市恒奥科技发展有限公司）。栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为110749-200714，110715-200815，110821-200711）；炎热清片（样品1，吉林国药制药有限责任公司，批号为20130301；样品2，吉林天药本草堂制药有限公司，批号为120801；样品3，武汉钧安制药有限公司，批号为130201）；水为超纯水，乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2　方法与结果

2.1溶液制备

精密称取栀子苷、黄芩苷、汉黄芩素对照品适量，以甲醇为溶剂，配制成混合对照品溶液，其中含栀子苷0.430 5 g/L、黄芩苷0.436 4 g/L、汉黄芩素0.115 3 g/L。取本品10片，除去包衣后，精密称定，研细，取约0.5片的量，精密称定，精密加入70%乙醇20mL，称定质量，超声处理（功率250W，频率40 kHz）40min，放冷，用乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方比例，分别配制缺栀子和缺黄芩的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2色谱条件系统适用性试验

色谱柱：Eclipse XDB柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脱流动相比例见表1；流速：0.80mL/min；检测波长：0～10min为238 nm，10.01～45min为275 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。理论板数按栀子苷峰计应不低于1 500［2］。分别取2.1项下3种溶液注入色谱仪，色谱图见图1。在此色谱条件下，栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素与相邻组分峰的分离度均大于1.5，阴性样品在与对照品色谱峰相应的位置上无吸收峰，表明处方中的其他成分对测定结果无影响。

2.3方法学考察

线性关系考察：取2.1项下混合对照品溶液，倍比稀释法配置成系列质量浓度的溶液。进样10μL，测定各组分峰面积，以各组分质量浓度（C）横坐标、相应峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程，栀子苷为A=17.974C+13.081（r=0.999 8），黄芩苷为A=16.210C+4.696 7（r=1.000 0），汉黄芩素为A= 23.840C+2.288 7（r=0.999 9），栀子苷、黄芩苷和汉黄芩苷质量浓度分别在4.30～86.10μg/mL，4.36～175.00μg/mL和1.15～46.10μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

表1　梯度洗脱流动相比例

图1　高效液相色谱图

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10μL，按上述色谱条件重复进样6次，结果栀子苷、黄芩苷、汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.03%，0.29%，0.95%（n=6）。

重复性试验：取同一批样品约0.5片的量,共6份，精密称定，依法制备供试品溶液，进样10μL。结果栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素含量的RSD分别为1.26%，0.78%，1.19%（n=6）。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别在0，1，2，4，6，8，10，12 h时进样10μL，记录色谱峰面积。结果栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.22%，0.87%，1.08%（n=8）。

加样回收试验：精密量取已测定栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素含量的样品（批号为20130301）9份（每份约0.25片的量），精密称定，分别精密加入一定量的栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素对照品，按供试品溶液制备方法制备溶液并进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2　加样回收试验结果（n=9）

2.4样品含量测定

取不同批号的样品，按供试品溶液制备方法处理并测定，以外标一点法计算栀子苷、黄芩苷和汉黄芩素的含量（以每片含量计），结果见表3。

表3　样品含量测定结果（n=3）

3　讨论

尝试用单一流动相洗脱，比较了乙腈-水（15∶85）、甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）［2］，结果分离效果差或只能测单一成分；用甲醇-0.2%磷酸溶液［5］、乙腈（A）-1%的磷酸溶液［6］等不同组成的流动相进行梯度洗脱，效果都不理想。故选择乙腈-0.4%磷酸溶液为流动相，各成分分离较好，峰形较佳。

经紫外吸收测定，栀子苷于238 nm波长处有最大吸收，黄芩苷于276，315 nm波长处有最大吸收，汉黄芩素于275 nm波长处有最大吸收。当选择单一波长测定时，则必有其中的1个成分响应值很小，而由于汉黄芩素含量较黄芩苷低很多，为提高汉黄芩素的检测灵敏度，故选用275 nm为切换测定波长。通过比较，选择检测波长在0～10min为238 nm、10.01～45min为275 nm同时测定3个成分的效果较佳。

分别用甲醇、乙醇、50%甲醇、70%乙醇作为提取溶剂，超声提取40min或70%乙醇超声提取20，30，40，50min等进行提取考察。结果以甲醇为溶剂的提取方法最简便、提取完全。

本试验结果显示，不同厂家、不同批号的炎热清片中栀子苷和汉黄芩素的含量有差别，特别是汉黄芩素的含量，提示不同生产工艺制备出的炎热清片内在质量有差异。炎热清片现有的质量控制方法较简单，不能有效地控制质量，本试验中所建立的方法简单、可靠，可作为评价炎热清片的质量标准之一。

［1］YBZ06252008.国家食品药品监督管理局药品标准［S］.

［2］赵昱玮，于淼，司学玲，等.炎热清片中龙胆苦苷的薄层鉴别及含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（3）：118-120.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：231，282.

［4］戢艳琼，李洪亮，张秋芳.HPLC法测定复方鱼腥草合剂中绿原酸、黄芩苷的含量的含量［J］.中国药师，2012，15（6）：828-830.

［5］费毅琴，聂晶.HPLC法同时测定清热解毒软胶囊中黄芩苷和栀子苷的含量［J］.中国药事，2012，26（5）：490-493.

［6］周蓬，宋青，马帅.HPLC法同时测定小儿豉翘清热颗粒中栀子苷、芍药苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素［J］.中成药，2013，35（8）：1 693-1 696.

［7］刘阿静，齐广才，刘珍叶，等.RP-HPLC法测定防风通圣丸中芍药苷、栀子苷、黄芩苷和连翘苷的含量［J］.西北药学杂志，2012，27（5）：415-417，437.

［8］赵霞，杨丽.HPLC法测定双黄连颗粒中栀子苷的含量［J］.中国药事，2012，26（1）：59-60，63.

［9］周燕，俞秀.HPLC法测定双黄连胶囊中栀子苷、黄芩苷、连翘苷的含量［J］.中国药师，2012，15（1）：72-74.

［10］乔静，李洪亮.HPLC法同时测定大卫颗粒中栀子苷、连翘苷、黄芩苷的含量［J］.中国药师，2011，14（7）：985-986.

Determ ination of Geniposide，Baicalin and W ogonin in Yanreqing Tabelts by HPLC

Ning Kexian1，Huang Yanping2
（1.Depa rtment of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，NanNing，Guangxi，China 530021；
2.The Food and Drud Inspection of BeiHai，Guangxi，China 536000）

Objective An HPLC method was established for the determination of geniposide,baicalin and wogonin in Yanreqing Tablets. M ethods Eclipse XDB column（150 mm×4.6 mm,5μm）was used with the mobile phase of acetonitrile-0.4%phosphoric acid solution by gradient elutio,the flow rate was 0.80 mL/min.The detection wavelength was 0-10 min,238 nm,10.01-45 min,275 nm. Results The HPLC method showed agood linear relationship in the range of 4.30-86.10μg/mL（r=0.999 8）for geniposide,4.36-175.00μg/mL（r=1.000 0）for baicalin,1.15-46.10μg/mL（r=0.999 9）for wogonin.Recoveries for the three components were all above 98%.Conclusion The method is simple，accurate with good reproducibility，and can be used for the quality control of the Yanreqing Tabelts.

HPLC；geniposide；baicalin；wogonin；Yanreqing tablets

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）16-0089-03?

宁科贤，主管药师，主要从事临床药学工作，（电话）0771-5305902（电子信箱）1094452708@qq.com；黄燕萍，主任药师，研究方向为食品与药品检验，本文通讯作者，（电话）0779-6803508（电子信箱）huangyanping500@163.com。

2014-11-28）