复方灵芝孢子精油软胶囊抗疲劳增强免疫力作用研究*

2015-10-24鲍蕾蕾杨帆陈海飞卞俊唐大海

中国药业 2015年16期

鲍蕾蕾，杨帆，陈海飞，卞俊，唐大海

（1.中国人民解放军第411医院药学科，上海200434；2.中国人民解放军总政治部白石桥干管局青年湖干休点，北京100011；3.中国人民解放军第411医院检验科，上海200434）

鲍蕾蕾1，杨帆2，陈海飞1，卞俊1，唐大海3

目的研究复方灵芝孢子精油软胶囊抗疲劳、增强免疫力的药理作用。方法将昆明种小鼠随机分为5组，分别为复方灵芝孢子精油软胶囊（FFLZB）低、中、高［385，770，1 540mg/（kg·d）］剂量组、对照药红参醇提物组、空白对照组，灌胃给药14 d后考察各组小鼠爬杆时间及爬杆后血清肌酸激酶（CK）、三磷酸腺苷（ATP）水平，同时采用免疫脏器指数法、碳粒廓清法、足趾增厚法测定迟发型变态反应（DTH），考察FFLZB对小鼠免疫功能的影响。结果高、中、低剂量FFLZB能不同程度地延长小鼠爬杆时间，高、中剂量能显著提高小鼠爬杆后血清ATP水平，仅低剂量能使爬杆后的小鼠血清CK酶水平显著提高；与空白对照组相比，FFLZB高、中、低3个剂量能不同程度地抑制小鼠免疫器官脏器指数的下降，提高碳粒廓清指数水平及24，48 h迟发型变态反应程度。结论复方灵芝孢子精油软胶囊具有抗疲劳及增强免疫力作用，是一种有效的抗疲劳复方中药制剂。

抗疲劳；免疫功能；灵芝孢子精油；小鼠

复方灵芝孢子精油软胶囊为中药复方制剂，由灵芝孢子粉、人参、红景天、黄芪、刺五加5味中药组方，方中灵芝孢子粉益精气、坚筋骨、调睡眠，人参补五脏、安精神，红景天补气强心、活血止血、祛燥火，黄芪助气、壮筋、长肉，刺五加调和诸药。该复方制剂具有抗运动性疲劳、提高机体免疫力、增强体力、保护脏腑组织的作用。本试验中通过小鼠爬杆疲劳模型及各种免疫指标的观察，研究了复方灵芝孢子精油软胶囊对运动性疲劳及免疫功能的保护作用，现报道如下。

1　材料与方法

1.1仪器、动物与试药

MS6002S型分析天平（梅特勒公司）；Multiskan Mk3型酶标仪（Thermo公司）；UV2550型紫外分光光度计（Shimadzu公司）；RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；HHS-4型恒温水浴锅（上海跃进医疗机械厂）；离心机（上海离心机厂）。昆明种小鼠210只，雌雄各半，体重（20±2）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（沪）2007-0005。复方灵芝孢子精油软胶囊由灵芝孢子粉经超临界流体萃取技术得到灵芝孢子精油后与人参、黄芪、红景天、刺五加等药材提取物制成的软胶囊制剂（中国人民解放军第411医院，批号为20111022），规格为每粒含生药4 g；阳性对照药为红参醇提取物（10倍量75%乙醇，回流提取3次，每次1 h，用蒸馏水加少许吐温-80配成剂量为400mg/kg的混悬液）；空白对照药为福临门大豆油（批号为20110518）；小鼠血清肌酸激酶（CK）、小鼠血清三磷酸腺苷（ATP）检测试剂盒［均为酶联免疫吸附（ELISA）法，美国TSZ公司，批号分别为20120310和20120313］；注射用环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号为12040625）；印度墨汁（南京都莱生物技术有限公司，批号为20111202）。

1.2试验方法

剂量设计及药液配制：按复方灵芝孢子精油软胶囊处方制成给药组，以人给药剂量折算为小鼠的低剂量，高、中、低剂量组（A1，A2，A3组）的剂量按4∶2∶1比例折算为1540，770，385mg/（kg·d），以空白对照药为稀释剂；阳性对照组（B组）给予红参醇提取物，剂量为400mg/（kg·d）；空白对照组（C组）给予大豆油。以上各组均为口服灌胃给药，给药体积为每20 g体重0.1mL。

小鼠爬杆试验及血清CK及ATP测定［1-2］：取昆明种小鼠50只，随机分为5组，各10只，分组灌胃给药，每日1次，连续14 d。末次给药1 h后，置小鼠于长100 cm、直径0.6 cm的光滑玻璃杆上，玻璃杆末端距离地面40 cm，使小鼠肌肉处于静力紧张状态，记时，观察小鼠因肌肉疲劳无力从玻璃杆上滑落下来的时间，第2次滑落试验结束，累计2次时间作为小鼠爬杆时间。同时，摘取小鼠眼球取血，4℃下静置1 h后，以3 000 r/min的速率离心10min，取血清，保存于-80℃，按试剂盒要求测定血清CK和ATP。

对免疫抑制小鼠免疫脏器指数的影响：取昆明种小鼠60只，随机分为6组，各10只，分组灌胃给药，每日1次，连续14 d。试验第11天，除C组外，各组小鼠分别以50mg/kg腹腔注射环磷腺胺，连续3 d，造成动物免疫抑制模型，C组腹腔注射等量生理盐水［3］。第14天给药1 h后，脱臼处死小鼠，称体重，取脾脏、胸腺，称湿重，并按下列公式计算脾指数和胸腺指数。脾指数=脾重/体重（mg/g），胸腺指数=胸腺重/体重（mg/g）。

碳粒廓清试验：取昆明种小鼠50只，随机分为5组，各10只，分组给药，连续14 d。复制免疫低下模型，方法同“对免疫抑制小鼠免疫脏指数的影响”项。于末次给药1 h后尾静脉注射体积分数为20%的印度墨汁10 mL/kg，然后分别于1，5 min用定量毛细管于每鼠眼球后静脉丛取血0.02 mL，立刻吹入2 mL质量分数为0.1%的Na2CO3溶液中，吹出数次以充分洗出吸管壁附着的血液，取血完毕后以2mL质量分数为0.1%Na2CO3溶液校零，680 nm波长测吸光度（A）［4-5］。处死小鼠，称体重，取肝脏、脾脏称湿量。计算廓清指数K及吞噬系数（校正吞噬指数），k值经体重及肝脾质量换算后得吞噬指数ɑ。廓清指数K=（log A1-log A5）/（T5-T1），A1和A5分别为1，5min时的吸光度；吞噬指数ɑ=体重/（肝重+脾重）×K1/3。

足跖增厚法测定小鼠迟发型变态反应（DTH）［4-5］：取昆明种小鼠50只，随机分为5组，各10只，分组给药，连续14 d。于给药后11 d对小鼠进行致敏，每只小鼠腹腔注射2%（v/v）绵羊红细胞每只0.2mL进行免疫。免疫4 d后，测量左后足跖部厚度，在测量部位皮下注射20%（v/v）绵羊红细胞每只20μL，于注射后24，48 h时分别测量左右足跖部厚度，同一部位测量3次，取平均值。

1.3统计学处理

2　结果

2.1小鼠爬杆试验

结果见表1。可见，相比C组，A1，A2，A3组可不同程度地增加小鼠爬杆时间，且有显著性差异，同时小鼠血清ATP及CK值均有不同程度的提高。

2.2对免疫抑制小鼠免疫脏器指数的影响

结果见表2。可见，腹腔注射50 mg/kg环磷酰胺能显著降低小鼠的脾脏、胸腺指数；相比模型组（D组），A1组及A2组脾脏、胸腺指数显著提高。

2.3小鼠碳粒廓清试验

结果见表3。可见，相比C组，A1，A2，A3组小鼠的碳粒廓清指数K及吞噬指数ɑ均显著提高，其中A1组和A2组相比C组有显著性差异。

2.4足跖增厚法测定小鼠DTH结果

结果见表4。可见，各组小鼠经绵羊红细胞诱导24，48 h，与C组比较，A1组及A2组由绵羊红细胞引起的DTH反应明显被抑制（P＜0.01及P＜0.05）。

表1　FFLBZ对小鼠爬杆试验及血清ATP，CK值的影响（±s，n=10）

注：与C组比较，*P＜0.05，△P＜0.01。表3和表4同。

组别A1组A2组A3组B组C组CK（U/L）116.45±4.51 118.54±5.80 119.02±5.13*118.46±6.59 115.55±4.88剂量［mg/（kg·d）］1 540 770 385 400 -爬杆时间（min）9.88±3.29△7.60±2.72*6.73±1.91*7.61±1.64*5.95±1.69 ATP（nmol/L）219.83±8.03△207.30±7.59*206.06±10.96 218.89±11.79△198.11±8.54

表2　FFLBZ对免疫抑制小鼠免疫脏器指数的影响（±s，n=10）

注：与D组比较，*P＜0.05，△P＜0.01。

组别A1组A2组A3组B组C组D组剂量［mg/（kg·d）］1 540 770 385 400 --脾脏（mg）70.7±18.8 65.7±11.9 51.9±8.3 46.0±8.7 145.2±23.6 53.8±11.8胸腺（mg）42.4±8.1 41.5±5.2 31.7±9.1 31.4±5.2 97.9±18.9 32.8±4.2脾脏指数（mg/g）2.1±0.7*1.9±0.4 1.8±0.3 1.6±0.3 5.3±0.5 1.8±0.2胸腺指数（mg/g）1.4±0.3△1.3±0.2*1.1±0.3 1.1±0.3 3.9±0.4 1.1±0.2

表3　小鼠碳粒廓清试验测定结果（±s，n=10）

组别A1组A2组A3组B组C组K ɑ 5.871±0.399 6.899±1.047△6.513±1.146*6.057±0.750 5.697±0.873剂量［mg/（kg·d）］1 540 770 385 400 -0.035±0.010 0.059±0.022 0.042±0.021 0.036±0.009 0.0248±0.023

表4　小鼠迟发型变态反应测定结果（±s，n=10）

组别剂量［mg/（kg·d）］足跖部厚度（mm）A1组A2组A3组B组C组1 540 770 385 400 -24 h 0.45±0.09△0.46±0.07△0.35±0.08 0.33±0.06*0.31±0.08 48 h 0.41±0.07△0.40±0.05*0.33±0.06 0.32±0.06*0.29±0.07

3　讨论

运动性疲劳是指机体生理过程不能持续其机能在一特定水平上和（或）不能维持预定的运动强度［6］的现象。也就是说，运动疲劳的发生最直接和最客观的表现是机体运动耐力的下降。本研究中，小鼠爬杆时间可作为判断其体力强壮程度、抗疲劳能力的客观指标。由试验结果可见，复方灵芝孢子精油软胶囊的不同剂量组小鼠的爬杆时间均有一定程度延长，其中以中剂量组最明显。

CK是骨骼肌能量代谢的关键酶之一，其作用是催化ATP和磷酸肌酸之间高能磷酸键可逆转移。它是短时间激烈运动时能量供应和运动后ATP恢复反应的主要催化酶，与运动时、运动后能量平衡及转移有密切关系。运动负荷的大小、肌肉酸痛与血清中CK水平高度相关［7-8］。正常情况下，肌细胞膜结构完整、功能正常，使CK极少渗出细胞膜而进入血液；但在剧烈运动时，无论是大强度还是低强度的训练都会促使细胞内CK释放，使血清中CK水平升高。因此，血清CK活性的变化可作为评定机体疲劳和了解骨骼肌微细结构损伤及其适应与恢复的重要敏感生化指标［9］。本研究结果显示，复方灵芝孢子精油软胶囊仅低剂量组小鼠血清CK水平比对照组显著提高，高、中剂量组小鼠爬杆时间虽较空白对照组有显著延长，但血清CK水平无明显变化。同时，小鼠血清ATP水平与爬杆时间呈正相关，提示复方灵芝孢子精油软胶囊能抑制小鼠因爬杆运动而造成的血清CK水平的上升和增加血清ATP水平的作用。

大强度运动造成的疲劳可降低巨噬细胞分泌免疫细胞因子的能力，降低机体免疫力［10］，使机体不可避免地出现明显的应激反应，应激反应引起某些应激激素增加，从而抑制免疫球蛋白的作用，导致机体的免疫机能下降。另外，物质代谢紊乱和免疫系统物质供应不足也是免疫机能下降的重要因素。胸腺为初级淋巴器官，游走的造血干细胞进入胸腺原基，分化增殖成T淋巴细胞，与细胞免疫有关。免疫抑制模型的脏器指数测定试验结果表明，复方灵芝孢子精油软胶囊高、中剂量组能显著提高小鼠的胸腺指数。碳粒廓清试验考察单核巨噬细胞的吞噬功能，印度墨汁是一种较强的抗原性异物，单核巨噬细胞具有吞噬体内抗原性异物的功能，是体内一种重要的非特异性免疫细胞。试验结果表明，复方灵芝孢子精油软胶囊中、低剂量组能显著提高小鼠的廓清指数，提示复方灵芝孢子精油软胶囊具有提高单核巨噬细胞吞噬异物的能力。同时，该制剂的高、中剂量组能显著提高小鼠迟发性变态反应引起的足跖增厚。

综上所述，复方灵芝孢子精油软胶囊可通过抑制大强度运动小鼠细胞内CK的积聚、增加血清ATP的含量而延长小鼠爬杆时间，还具有提高免疫力低下小鼠免疫脏器指数，提高细胞吞噬功能，抑制迟发型变态反应的作用，这种增强免疫力的功能可能与其抗运动性疲劳作用有一定相关性。

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Effect of Compound Ganoderma Lucidum Spore Oil Soft Capsule on Antifatigue and Immunopotentiation

Bao Leilei1，Yang Fan2，Chen Haifei1，Bian Jun1，Tang Dahai3
（1.Department of Pharmacy，411 Hospital of PLA，Shanghai，China 200434；2.Qingnian Lake Cadre′s Sanitarium，Baishiqiao Cardres Administration Bureau，
General Political Department of PLA，Beijing，China 100011；3.Department of Clinical Laboratory，411 Hospital of PLA，Shanghai，China 200434）

Objective To research the pharmacological effect of antifatigue and immunopotentiation of Compound Ganoderma Lucidum Spore Oil Soft Capsule.M ethods Kunming mice were radomly devided into five groups：the low，middle and high FFLZB doses groups［385，770，1 540 mg/（kg·d）］，control red gingseng ethanol extract group and blank control group.The pole-climbing time，serum creatinine kinase（CK）and adenosine triphosphate（ATP）contents on 14 d after medication gavage were detected.At the same time the immune organ index method，cleaning carbon particle method and digits thickening method were adopted to detect delayed type hepersensitivity（DTH）for investigating the influence of CGOC on mice′s immune function.Results The high，middle and low doses FFLZB groups could prolong the pole-climbing time in different degrees，the middle and high doses groups could significantly increase the serum ATP level after pole-climbing，only the low dose group could significantly increase serum CK level after pole-climbing；compared with the blank control group，the high，middle and low FFLZB doses groups could inhibit the decrease of mice immune organ index in different degrees，increased the level of leaning carbon particles and 24，48 h DTH degree.Conclusion FFLZB has the antifatigue and immunopotentiation effect and is a compound Chinese medicine preparation for effective antifatigue.

antifatigue；immune function；FFLZB；mice

R285.5；R286

1006-4931（2015）16-0014-03

鲍蕾蕾（1979-），女，硕士研究生，主管药师，研究方向为中药药理活性成分研究，（电话）021-65283984-15（电子信箱）annabao212@qq.com。

2015-03-18）

*全军医学科学技术研究“十二五”面上课题，项目编号：CWS11J178；上海市卫生局青年基金项目，项目编号：2009Y118。