高效液相色谱法测定糖肾宝颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量

杨巧虹，万萌萌，白梦娜，谭睿，宋英，盛荣

（1.重庆医疗器械质量检验中心，重庆401147；2.西南交通大学生命科学与工程学院，四川成都610031，3.成都中医药大学附属医院，四川成都610075）

高效液相色谱法测定糖肾宝颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量

杨巧虹1，万萌萌2，白梦娜2，谭睿2，宋英3，盛荣3

（1.重庆医疗器械质量检验中心，重庆401147；2.西南交通大学生命科学与工程学院，四川成都610031，3.成都中医药大学附属医院，四川成都610075）

目的建立测定糖肾宝颗粒君药黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法色谱柱为Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为0.2%甲酸-乙腈，梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长260 nm，柱温30℃。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量在0.01～0.32μg范围内与峰面积线性关系良好，线性回归方程Y=2 513 055.3X+39 095（r2=1.00）。毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均加样回收率为101.53%，RSD=2.85%（n=6）。结论该方法简便、准确、专属性强，可用于测定糖肾宝颗粒君药黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。

糖肾宝颗粒；黄芪；毛蕊异黄酮葡萄糖苷；高效液相色谱法

Yang Qiaohong1，Wan Mengmeng2，Bai Mengna2，Tan Rui2，Song Ying3，Sheng Rong3

（1.Chongqing Quality Testing and Inspection Center for Medical Devices，Chongqing，China 401147；2.Southwest Jiaotong University，

Chengdu，Sichuan，China 610031；3.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM，Chengdu，Sichuan，China 610075）

糖肾宝颗粒为中药复方制剂，由黄芪、金樱子、川芎等中药组方。黄芪为方中君药，故选择其所含毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为控制产品质量的指标成分。已报道的毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定方法有薄层扫描法、超临界萃取气相色谱-质谱（GC-MS）分析法、气相色谱法、毛细管气相色谱法、高效液相色谱（HPLC）法及反相高效液相色谱法等。笔者参考2010年版《中国药典（一部）》及文献［1-5］，建立了测定糖肾宝颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的HPLC法，旨在为产品质量标准的提高与完善提供依据，现报道如下。

1　仪器与试药

岛津LC-6AD高效液相色谱仪；Sartorius BS110十万分之一电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ5200DE型数控超声波清洗器。糖肾宝颗粒（批号为20120920，20120921，20120922），缺黄芪阴性样品（批号为20120923），均由成都中医药大学附属医院药剂科提供；毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，供含量测定用，纯度98%，批号为MUST-11042915）。

2　方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性试验［2，6-12］

色谱柱：KromasilC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱温：30℃；流动相：A为乙腈，B为0.2%甲酸溶液，梯度洗脱（见表1）；流速：1.0mL/min；检测波长：260 nm；进样量：10μL。在此条件下，理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于3 000，色谱图见图1。

表1　流动相梯度洗脱表

图1　高效液相色谱图

2.2溶液制备

取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含16μg的溶液，即得对照品溶液。取本品（批号为20120921），研细，取5.2 g，精密称定，置50mL容量瓶中，加甲醇溶液，超声处理（功率250W，频率40 kHz）30min，放冷，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺黄芪阴性样品（批号为20120923），按供试品溶液制备方法同法操作，即得阴性对照品溶液。

2.3方法学考察

专属性试验：精密吸取2.2项下3种溶液各10μL，按拟订色谱条件进样测定。结果，供试品溶液色谱中，毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱峰与相邻色谱峰达到了基线分离，理论塔板数不低于3 000，分离度大于1.5，阴性无干扰（见图1）。

线性关系考察：精密吸取对照品溶液（0.2 g/L）0.05，0.20，0.40，0.80，1.60 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，精密吸取各对照品溶液10μL进样，按拟订色谱条件测定峰面积。以峰面积（Y）对进样量（X）进行线性回归，得回归方程Y=2 513 055.3 X+39 095，r2=1.00（n=5）。结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量在0.01～0.32μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液（0.032 g/L）10μL，按拟订色谱条件连续进样测定。结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均峰面积为839 103，RSD=0.95%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液10μL，于制备后0，2，4，6，8，12 h时进样测定含量。结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均含量为0.1347mg/g，RSD=1.60%（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定。

重复性试验：取样品（批号为20120922），精密称定，依法制备供试品溶液，进样测定峰面积，计算含量。结果，毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均含量为0.136 7 mg/g，RSD=1.35%（n=6），表明方法的重复性较好。

加样回收试验：取样品（批号为20120921），研细，取2.6 g（0.136 7 mg/g）共6份，精密称定，分别精密加入对照品溶液（0.038 6 g/L）10mL，按供试品溶液的制备方法制备溶液，进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2　毛蕊异黄酮葡萄糖苷加样回收试验结果（n=6）

2.4样品含量测定

取3批中试样品，依法制备供试品溶液，精密吸取10μL，按拟订的色谱条件测定，计算含量，结果见表3。2010年版《中国药典（一部）》“黄芪”项下饮片相关规定，黄芪饮片中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量不得少于0.2mg/g，3批样品的含量测定结果平均为0.141 9mg/g，该制剂处方中黄芪饮片毛蕊异黄酮葡萄糖苷的转移率为57%。考虑到大生产中含量有一定范围的波动，将毛蕊异黄酮葡萄糖苷转移率下浮10%，故以转移率47%计算该制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量不得低于0.047mg/g。根据稳定性试验要求，指标成分含量的改变应小于20%，暂订糖肾宝颗粒含量以毛蕊异黄酮葡萄糖苷（C22H22O10）计，不得低于0.037 6mg/g。

表3　样品含量测定结果

3　讨论

选择检测波长时，取对照品溶液进行190～700 nm全波长扫描，发现在260 nm波长处有最大吸收，结合相关文献，确定260 nm为检测波长。色谱柱的选择考察了APhenomenex C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），Agilent C18柱（150mm×4.6mm，5μm），Kromasil C18柱（250mm×4.6 mm，5μm），结果均有较好的保留时间和峰形，与杂质能很好地分离，理论板数均大于3 000，但最终选择Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱。对流速0.8～1.2mL/min进行考察，结果流速在1.0mL/min时分离好，样品稳定。对柱温进行考察，结果柱温在25～35℃时，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量无明显变化，故选用柱温为30℃。

［1］姚雪莲，裴彩云，王宗权.不同产地、不同采收期黄芪药材及饮片中毛蕊异黄酮葡萄糖苷及芒柄花素含量测定［J］.药物分析杂志，2007，12（5）：52-56.

［2］梁丽娟，赵奎君，屠鹏飞，等.HPLC法同时测定黄芪中4种黄酮类成分的含量［J］.中国药房，2010，21（15）：1 385-1 387.

［3］纪松岗，李翔，娄子洋，等.高效液相色谱法测定黄芪中毛蕊异黄酮苷和芒柄花素的含量［J］.第二军医大学学报，2006，27（1）：81-84.

［4］黄月纯，尹雪，魏刚.玉屏风方饮片及汤剂中毛蕊异黄酮苷，升麻素苷，5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量相关性研究［J］.中国实验方剂学杂志，2008，14（6）：42-45.

［5］薛改进，赵云丽，郝杰，等.HPLC法同时测定抗敏颗粒中芍药苷，毛蕊异黄酮苷和阿魏酸的含量［J］.中国药房，2010，21（23）：2168-2170.

［6］蔡海霞，陈君，李萍.一测多评法测定黄芪中4种异黄酮的含量［J］.中国中药杂志，2010，35（20）：2 712-2 717.

［7］陈有根，辛敏通，杨滨.野生与栽培黄芪中毛蕊异黄酮苷的测定［J］.中草药，2009，40（9）：1 484-1 485.

［8］赵宝山.黄芪中毛蕊异黄酮与芒柄花素高效提取工艺研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2012.

［9］石子仪，鲍忠，姜勇，等.不同来源黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的定量分析［J］.中国中药杂志，2007，32（9）：779-783.

［10］张英丰，朱黎霞，梁东辉，等.HPLC同时测定黄芪白术药对提取物毛蕊异黄酮苷，白术内酯Ⅰ，白术内酯Ⅲ含量［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（9）：86-89.

［11］梁东辉，朱黎霞，张英丰，等.高效液相色谱法测定黄芪提取物毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷含量［J］.现代医药卫生，2012，28（8）：1126-1 127.

［12］陈平，莫炫永.高效液相色谱法测定翁沥通胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量［J］.中国药业，2012，21（15）：41-42.

Determ ination of Calycosin G lucoside in Tangshenbao Granules by HPLC

Objective To establish a method for quality control of Tangshenbao Granules.M ethods The chromatography column was Kromasil C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）.The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.2%formic acid with the gradient elution at a flow rate of 1 mL/min，at 30℃.Results Calycosin glucoside showed a good linear relationship within the range of 0.01～0.32μg，Y=2 513 055.3X+39 095（r2=1.00），the average recovery rate was 101.53%，RSD=2.85%（n=6）.Conclusion The methods are simple，exact and reproducible，and can be used for the qualitative and quantitative control of Tangshenbao Granules.

Tangshenbao Granules；milkvetch root；calycosin glucoside；HPLC

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）16-0085-03

杨巧虹（1977-），女，大学本科，主要从事医疗器械质量检验工作，（电子信箱）87831702@qq.com；万萌萌，女，在读硕士研究生，研究方向为中药质量标准规范化和新制剂研发，（电子信箱）774235565@qq.com；谭睿，女，博士研究生，教授，研究方向为中药质量标准规范化和新制剂研发，本文通讯作者，（电话）028-87600993（电子信箱）tanrui@swjtu.edu.cn。

2015-01-22；

2015-04-22）