P2Y12基因多态性与冠心病患者氯吡格雷抵抗的相关性研究

张文斌 张新霞 陈晓燕 莫怡浩 伍贵富

P2Y12基因多态性与冠心病患者氯吡格雷抵抗的相关性研究

张文斌 张新霞 陈晓燕 莫怡浩 伍贵富

目的 探讨冠心病患者血小板二磷酸腺苷（ADP）受体亚基12（P2Y12）基因多态性位点rs6798347的分布特征及其与氯吡格雷抵抗的相关性。方法 入选91例经冠状动脉造影或CT冠状动脉造影确诊的冠心病患者。给予充分的氯吡格雷治疗后，运用富血小板血浆光学法来测定患者服药后最大血小板聚集率。根据最大血小板聚集率将患者分成氯吡格雷抵抗组（CR）30例和非氯吡格雷抵抗组（NCR）61例。应用MassARRAY时间飞行质谱技术对患者P2Y12基因单核苷酸多态性位点rs6798347进行基因分型，比较两组患者基因型的分布情况以及不同基因型之间血小板聚集率的差异。结果 91例患者rs6798347成功分型90例，其中CR组（29例）的GG、AA、AG基因型分别有14例（48.28%）、5例（17.24%）、10例（34.48%）；NCR组（61例）的GG、AA、AG基因型分别有33例（54.10%）、5例（8.20%）、23例（37.70%）。两组基因型分布差异无统计学意义（均为P＞0.05），携带突变型等位基因A的患者服氯吡格雷后最大血小板聚集率有升高趋势（45.21%±16.67%比51.63%±16.18%，P=0.068）；部分CR的患者服用氯吡格雷后最大血小板聚集率高于其未服药时的基线值（68.70%±13.59%比58.90%±4.93%，P=0.046）；各基因型之间冠状动脉病变支数的差异无统计学意义（均为P＞0.05）。CR组与NCR组之间总胆固醇［（4.11±1.12）mmol/L比（4.81± 1.34）mmol/L，P=0.015］和低密度脂蛋白胆固醇［（2.18±0.81）mmol/L比（2.57±0.89）mmol/L，P= 0.049］水平差异均有统计学意义；但两组患者其余临床资料差异无统计学意义（均为P＞0.05）。结论（1）血小板膜P2Y12受体基因多态性位点rs6798347与冠心病患者CR的发生无明显关系；（2）血小板膜P2Y12受体基因多态性位点rs6798347的突变型等位基因可能影响氯吡格雷抗血小板聚集的能力。

基因； 多态性，单核苷酸； 受体，嘌呤能P2Y12； 动脉粥样硬化； 氯吡格雷抵抗

现已证实，氯吡格雷的抗血小板作用在不同个体间存在着变异。对氯吡格雷反应低下的情况，被称之为氯吡格雷抵抗［1］（clopidogrel resistant，CR）。CR可能是发生心血管血栓事件的原因之一。CR的发生机制尚不明确，随着对基因多态性研究的进一步深入，人们发现氯吡格雷的作用位点血小板二磷酸腺苷（ADP）受体亚基12（P2Y12）的基因多态性与CR的发生关系密切。来自中国的研究显示，P2Y12基因第34位以及第52位碱基的突变可能是发生CR的危险因素之一［2］，推测突变型基因携带者更易发生心血管不良事件。另有研究发现，P2Y12基因单核苷酸多态性位点rs9859552为突变型A纯合子的冠心病患者ADP诱导的血小板聚集率较野生型纯合子高17%～20%［3］。目前，鲜有针对中国人P2Y12基因多态性与CR的相关性研究，我们根据服用氯吡格雷后最大血小板聚集率检出CR的冠心病患者，同时对P2Y12受体基因多态性位点rs6798347进行分析，探讨其与实验室CR的相关性，为冠心病患者氯吡格雷个体化治疗提供一定的实验室依据。

1　对象和方法

1.1研究对象

入选2011年9月至2012年3月在深圳市福田人民医院心内科住院的冠心病（包括急性冠状动脉综合征和稳定型心绞痛）患者91例，男性60例、女性31例，年龄38～85岁，平均（63.7±11.8）岁。入选标准：中国人、18岁以上、经冠状动脉造影或CT冠状动脉造影明确诊断冠心病。排除标准：近3 d内使用过GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂、血小板计数＜100×109/L、有严重心功能不全、急慢性肝肾病变、短期内有外伤或外科手术围术期、有严重消化道出血症状。本研究已通过医院伦理委员会审查。

1.2给予氯吡格雷的方式

所有患者明确诊断冠心病后，均给予氯吡格雷治疗。因为患者不同的临床情况，为保证患者均能得到充分的氯吡格雷治疗，氯吡格雷的使用方法分为维持量75 mg/d治疗5 d，或者24 h内负荷300 mg继续维持量75 mg/d。

1.3血小板聚集率的检测

患者服用氯吡格雷前和服用氯吡格雷后第5天或服用负荷量氯吡格雷后，采取静脉血4 ml，与3.8%枸橼酸钠按9∶1混合抗凝。运用富血小板血浆光学法，以ADP作为诱导剂检测血小板聚集率。

1.4研究对象分组

将ADP诱导的血小板聚集率较基线值下降小于10%或氯吡格雷维持治疗时ADP诱导的血小板聚集率＞50%的患者归为氯吡格雷抵抗组（CR）［4］，未达到上述标准的归为非氯吡格雷抵抗组（NCR）。

1.5基因组DNA的提取及基因型的检测

将血液于3 000 rpm离心20 min，弃去血浆，将血细胞置于-80℃冰箱保存备用。按照金麦格全血基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，并采用美国SEQUENOM公司MassARRAY时间飞行质谱技术检测多态性位点rs6798347的基因型。

1.6随访

患者出院后1年对其主要不良心血管事件［MACE，即：（1）死亡；（2）发生非致命的心肌梗死；（3）发生非致命的脑血管事件；（4）心绞痛复发］进行电话随访。

1.7统计学方法

2　结果

2.1基线临床资料

共纳入91例患者，CR的患者占32.97%（30/ 91），NCR的患者占67.03%（61/91）。两组在年龄、性别构成比、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、三酰甘油（TG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、高血压、糖尿病、冠状动脉病变支数及吸烟史方面差异均无统计学意义（均为P＞0.05）；但NCR组的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及总胆固醇（TC）水平均较CR组高（均为P＜0.05）。见表1。

表1　CR组与NCR组患者基线临床资料比较

2.2CR组与NCR组血小板聚集率的比较

2.2.1服药后血小板聚集率比较 两组服药后最大血小板聚集率CR组（64.00%±10.10%）高于NCR组（40.79%±13.78%）（P=0.000）。

2.2.2服药前后血小板聚集率比较 首次诊断为冠心病的患者32例，服药前NCR组（n=22）最大血小板聚集率高于CR组（n=10）（P=0.001），而服药后NCR组最大血小板聚集率显著低于CR组（P =0.000）。两组间服药前后血小板聚集率变化幅度差异有统计学意义（P=0.000）。在组内比较发现，CR组服药后最大血小板聚集高于服药前（P= 0.046），NCR组服药后最大血小板聚集率低于服药前（P=0.000）。见表2。

表2　首次诊断为冠心病的患者服药前后血小板聚集率比较（，%）

表2　首次诊断为冠心病的患者服药前后血小板聚集率比较（，%）

注：与服药前比较，aP=0.046，bP=0.000

最大血小板聚集率CR（10例）NCR（22例）t值P值服药前 58.90±4.9372.32±15.49服药后 68.70±13.59a45.45±15.36b3.6730.001 4.1030.000变化幅度-9.80±10.4426.86±11.038.8570.000

2.2.3不同给药情况之间的比较 患者在住院期间严格按照医嘱服药。91例患者中，有9例采用24 h内负荷300 mg氯吡格雷的抗血小板策略，其余82例则使用常规量氯吡格雷75 mg/d至少5 d的抗血小板策略。两种给药方式的CR发生率和服药后最大血小板聚集率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.3CR组与NCR组基因型的分布情况

CR组中GG型14例，AA型5例，AG型10例；NCR组中GG型33例，AA型5例，AG型23例。两组中rs6798347位点各基因型分布差异无统计学意义（均为P＞0.05），各种基因型构成比之间差异无统计学意义（均为P＞0.05），等位基因频率的差异无统计学意义（均为P＞0.05）。两组患者服药前后血小板聚集率、基因型的分布情况和等位基因频率差异均无统计学意义（均为P＞0.05）（见表4～6）。

表3　不同给药方式之间的血小板聚集率比较

表4　CR组与NCR组基因型分布比较［例（%）］

表5　CR组与NCR组各基因型构成比较（例/例）

表6　CR组与NCR组等位基因频率的比较［例（%）］

2.4各基因型间服药后最大血小板聚集率比较

分型成功的90例患者，GG型47例，AA型10例，AG型33例。各基因型间服用氯吡格雷后最大血小板聚集率差异无统计学意义（均为P＞0.05）。两两比较，GG型（45.21%±16.67%）与AA型（51.10%±18.18%）、GG型与AG型（51.79%± 15.83%）间差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。2.5 随访结果

1年后对91例研究对象进行MACE的随访。NCR组61例，随访成功16例，其中1年内发生MACE的有5例（31.3%）；CR组30例，随访成功7例，有3例（42.9%）在1年内发生了MACE。两组之间1年发生MACE的差异无统计学意义（31.3%比42.9%，F=0.2892，P=0.657）。对随访病例按基因型分组，其中GG型12例，AG型10例，AA型1例，GG型有4例（33.3%）发生了MACE，AG型同样也有4例（40.0%）发生了MACE，仅随访到1例AA型的患者并未观察到MACE的发生。

3　讨论

冠状动脉支架置入术后的患者，在长期服用维持量氯吡格雷（75 mg/d）治疗的过程中一旦发生支架内血栓事件，心肌梗死的发生率高达60%～70%，死亡率高达15%～45%［5］。根据资料显示，约5%～30%的患者使用常规剂量氯吡格雷治疗不能有效抑制血小板聚集，发生CR［6-7］。Galiˊc等［8］的研究也显示，P2Y12基因单核苷酸多态性位点18C＞T能解释人群对氯吡格雷不同的药物反应。本研究入选的91例患者中，发生CR的有30例，CR的发生率为32.97%。

虽然Fontana等［9］认为携带突变基因患者的血小板聚集率更高，但是本研究中却未发现基因多态性与血小板聚集率有相关性。本研究的多态性位点rs6798347不同基因型的患者服用氯吡格雷后最大血小板聚集率分别是GG型（45.21%±16.67%），AA型（51.10%±18.18%），AG型（51.79%± 15.83%），之间差异无统计学意义（P=0.189）。在进行两两比较时，不同基因型之间仍差异无统计学意义（P＞0.05）。但本研究发现，携带有突变型A等位基因的患者服药后最大血小板聚集率有升高的趋势（45.21%±16.67%比51.63%±16.18%，P=0.068），提示突变型A等位基因可能会影响氯吡格雷抗血小板聚集。

Su等［10］认为，P2Y12基因启动子的甲基化或许能解释CR的发生。本研究的多态性位点rs6798347位于P2Y12受体基因的启动子区域［11］。但突变型A等位基因与CR发生无关。CR组与NCR组患者无论在基因型分布还是等位基因频率差异均无统计学意义（P＞0.05），究其原因可能是rs6787801位点未定位在P2Y12受体基因的启动子的关键区域，或者是与该位点未定位在基因的关键调控区有关；且本研究的样本量偏小，发生实验误差和抽样误差的几率更大，故需对P2Y12受体基因的功能区域进行更多的基础研究以及扩大研究的样本量来进一步分析。

并且，在Fontana和Rudez的研究中，均是对P2Y12基因多个单核苷酸多态性位点紧密连锁所构成的单倍型进行比较分析。这提示P2Y12受体参与血小板聚集的调节是受多基因所调控的。故本研究中多态性位点rs6787801可能与P2Y12基因的其他多态性位点一起协同参与了CR的发生。因此，后续研究将同时对多个多态性位点进行检测，来探讨CR的发生机制。

本研究检测了部分患者服用氯吡格雷前后的血小板聚集率。发现在CR组内部分患者（n=8）服药后最大血小板聚集率甚至高于服药前最大血小板聚集率，且存在统计学差异（58.90%±4.93%比68.70%±13.59%，P=0.046）。这部分患者服用常规治疗量氯吡格雷平均达7.88 d，有6例患者的rs6787801位点为野生型纯合子。同样的现象也出现在Gurbel等［1］的研究中。并且在使用氯吡格雷30 d之后，仍有11%的患者血小板聚集率较基线值高。提示部分患者对氯吡格雷的反应较差。本研究未发现多态性位点rs6798347与该现象有关。而在Gurbel的研究中，却发现随着治疗时间的延长，这部分患者所占的比例越来越少，提示延长氯吡格雷的治疗时间能使这部分患者获益。那么这部分CR是氯吡格雷治疗不充分的结果，或是该现象只是因为研究样本量太小所致，有待进一步观察。

本研究对比了CR组与NCR组1年内MACE的发生情况，因为失访的例数过多，故仅得到了差异无统计学意义的结果。但是NCR组MACE的发生率较CR组的更低（31.25%比42.86%），提示CR组有更大的可能发生MACE，需扩大样本量进一步研究。将随访病例进行基因分型后发现，位点rs6798347为野生型纯合子GG型患者的MACE发生率较低（33.33%比40.00%），这可能与突变型等位基因A影响了氯吡格雷抗血小板聚集有关。如果将来更大规模的前瞻性研究能明确突变型等位基因与MACE的相关性，则能对这部分患者做出早期预测，能更好地指导冠心病患者的抗血小板聚集治疗。

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Relationship between P2Y12 gene polymorphisms and clopidogrel resistance in patients with coronary heart disease

Zhang Wenbin，Zhang Xinxia，Chen Xiaoyan，Mo Yihao，Wu Guifu.Department of Cardiology，Shenzhen Futian Hospital Affiliated of Guangdong Medical College，Shenzhen 518033，China

Zhang Xinxia，Email：zhangoctober@163.com

Objective To investigate P2Y12 genetic polymorphisms in rs6798347 and its relationship with clopidogrel resistance in patients with coronary heart disease.Methods A total of 91 patients with coronary artery disease diagnosed by coronary angiography or coronary artery CT angiography were enrolled.Platelet aggregation rate was assessed by ADP-induced light-transmittance aggregometry after the patients received adequate clopidogrel pretreatment.Patients were divided into two groups（clopidogrel resistance group and non-clopidogrel resistance group）according to the ADP-induced platelet aggregation percentage.The genotype of P2Y12（rs6798347）was detected by MassARRAY Time of Flight MassSpectrometry.Genotype and allele frequency distribution were compared between the two groups.Results According to the ADP-induced platelet aggregation rate，29 patients were defined as clopidogrel resistance and 61 as non-clopidogrel resistance.Ninety patients were genotyped successfully.GG，AA，AG genotype frequencies were 14（48.28%），5（17.24%），10（34.48%）in clopidogrel resistance group and 33（54.10%），5（8.20%），23（37.70%）in non-clopidogrel resistance group，respectively（all P＞0.05）. Patients carrying the mutant gene had a trend of increased platelet aggregation percentage（45.21%± 16.67%vs.51.63%±16.18%，P=0.068）.The severity of coronary artery lesions was similar in different genotypes patients（all P＞0.05）.Conclusions （1）The single nucleotide polymorphisms of P2Y12 in rs6798347 is not associated with clopidogrel resistance in patients with coronary heart disease.（2）The mutant gene in rs6798347 may influence the antiplatelet ability of clopidogrel.

Genes； Polymorphism，single nucleotide； Receptors，purinergic P2Y12；Atherosclerosis； Clopidogrel resistance

2014-07-15）

（本文编辑：周白瑜）

10.3969/j.issn.1007-5410.2015.01.005

广东省医学科学技术研究基金（WSTJJ20121115）

518033广东医学院附属深圳市福田人民医院心内科

张新霞，电子信箱：zhangoctober@163.com