循环microRNA208a和208b在急性心肌梗死早期诊断中的价值

Osor Oyunbileg 李广平 王兴华 徐昭

循环microRNA208a和208b在急性心肌梗死早期诊断中的价值

Osor Oyunbileg 李广平 王兴华 徐昭

目的 探讨心肌特异性miR208a、miR208b作为早期急性心肌梗死（AMI）诊断指标的作用。方法 纳入天津医科大学第二医院住院的急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者30例，不稳定型心绞痛（UAP）患者20例及无心血管疾病（CVD）、心电图正常的健康人21例。所有入选者，以hs-nRNA U6为内参，利用SYBR实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCRs）检测血浆中miR208a和miR208b的表达量，采集AMI发病后12 h内外周静脉血，第一份血液样本采集于患者刚入住冠心病监护病房（CCU）时，另一份则采集于次日早上6点（PCI术结束的数小时后），分别测定miR208a、miR208b表达水平及cTnI的变化。结果 STEMI患者血浆中miR208a、miR208b表达水平显著高于健康对照组，分别为健康对照组的9.45倍（P＜0.001）和10.43倍（P＜0.001）。这些miRNA的表达水平在UAP患者血浆中均略有上升。19例急性STEMI患者胸痛发作3 h内，miR208a表达水平的升高率达100%（19例），miR208b表达水平的升高率达89.5%（17例），而患者同期cTnI呈阳性的比率仅有47.4%（9例）。STEMI患者与健康对照组的miR208a和miR208b的ROC曲线有明显差异，曲线下面积（AUC）分别为0.97（95%CI：0.937～1.011，P＜0.001）和0.938（95%CI：0.867～1.010，P＜0.001），但miR208a、miR208b在急性STEMI和UAP组之间比较，AUC分别为0.739和0.750，而cTnI的AUC为0.900。结论 血浆miR208a和miR208b可能是潜在的早期、快速、准确诊断AMI的生物标志物，但对STEMI和UAP进行鉴别诊断的价值有限，不及cTnI。

心肌梗死； 循环microRNA； 生物标志物； miR208a； miR208b

在所有已知的miRNA当中，miR208a和miR208b是最重要的心脏富集的miRNA，在心脏的发生发育与疾病过程中发挥着重要的作用。本研究拟采用实时荧光定量RT-PCR（QRT-PCR）检测ST段抬高型心肌梗死（ST segment elvation myocadial infarction，STEMI）患者心脏富集miRNAs（miR208a和miR208b）的表达量，并比较这些miRNA和cTnI对AMI的诊断价值。

1　对象和方法

1.1研究对象

对列入选2012年12月至2013年10月，症状发作后12 h内入住天津医科大学第二医院CCU病房的急性STEMI患者30例，UAP患者20例，以及参加健康体检的心电图正常、无心血管疾病的健康人21例。本研究经天津医科大学第二医院医学伦理委员会批准，取得了所有受试者知情同意。

急性STEMI患者的诊断参照最新版“心肌梗死全球统一定义”的AMI诊断标准［1］。UAP的诊断在明确的冠心病诊断的基础上，并有以下病史特征：（1）稳定性心绞痛加重（症状更重、持续时间更长或更频繁）；（2）新出现的心绞痛，通常在1个月内，较轻劳力活动即可诱发心绞痛；（3）在静息或进行轻度劳力活动时自发出现心绞痛，且不伴有肌酸激酶同工酶（CK-MB）和cTnI等血清标志物的升高。合并严重感染、泵功能衰竭、休克、急性脑卒中和严重肝肾功能损害者不入选。

1.2血液标本的采集和存储

取血时间为AMI发病后12 h内，平均（3.5± 2.9）h。第一份血液样本采集于患者刚入住CCU时，另一份则采集于次日早上6点（PCI术结束的几个小时后）。另外，采集21例健康人的血液样本作对照。抽取2.5 ml外周静脉血于ETDA管中，2 h内在4℃条件下2 000 r/s，离心15 min，分离血浆转移至新的无RNA酶的试管中，并存储于-80℃直至RNA分离。对所有参与本研究项目的患者血标本的miR208a、miR208b表达水平进行测定，并与标准生物标志物cTnI进行比较。

1.3测定血浆miRNA

采用miRNA提取试剂盒，从血浆分离miRNA（康为世纪，中国）。取400 μl血浆样本，加入1.0 ml Buffer RLM，振荡器振荡混匀30 s，室温放置5 min，然后在4℃条件下12 000 r/min离心5 min，使核蛋白核酸复合物完全解离。加入400 μl氯仿，振荡15 s，室温放置5 min。4℃12 000 r/min离心15 min，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，得到的溶液中加入无水乙醇。按照相应参考说明使用吸附柱RM和RS，随后向吸附柱RS中间部位加入30 μl无RNA酶水，收集miRNA溶液。

提取miRNA后，使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒（康为世纪，中国），将提取的miRNA反转录成单链cDNA。使用多腺苷酸聚合酶和ATP对提取的21 μl RNA进行多聚腺苷酸化。采用基因扩增仪（PEKLIN ELMER GeneAmp PCR System 2400）在miRNA末端加多聚A尾的方法来使miRNA具有Poly（A）尾，之后再使用SuperRT反转录酶和25 μmol/L RT引物进行反转录反应，最终合成20 μl cDNA。提取的cDNA于-20℃保存备用。

运用7500系列检测系统（Applied Biosystems）进行qRT-PCR反应。25 μl反应体系中含有2.5 μl反转录产物cDNA，0.5 μl正向引物，0.5 μl反向引物（miRNA qRT-PCR检测试剂盒所配备，康为世纪，中国），12.5 μl 2×miRNA qPCR premix（With SYBR and ROX）和9 μl无RNA酶水。设计的qRT-PCR正向引物如下：

miR208a：F-TGCGGTATAAGACGAGCAAA；

miR208b：F-TGCGGTATAAGACGAACAAAA。

整个反应体系先95℃孵育10 min，然后45个循环（95℃15 s，60℃1 min），每个反应体系安排2个复孔。目前，还没有统一的使用于qRT-PCR的特定内参。所有qRT-PCR采用相对定量进行分析，以hs-nRNA U6（HmiRQP9001，GeneCopoeia）作为内参进行校正和标准化［2-3］。采用2-ΔΔCt法分析相对表达量。qRT-PCR检测得到的Ct值大于40，视为不表达。血浆miRNA表达水平以倍数变化表示。

1.4 血清标志物检测

所有入选者同时抽取血清标本进行cTnI、肌酸激酶（CK）及CK-MB测量，分析cTnI、CK、CK-MB对于诊断AMI的敏感性、特异性及准确性。参照制造商提供的相应说明，血浆cTnI的浓度由电化学发光法（ELISA）测定。参考值范围为cTnI≤0.02 ng/ml。

1.5统计学方法

数据分析及图片制作在SPSS 16.0统计学分析软件上完成。计量数据以（正态分布）、中位数（四分位距）（非正态分布）或分类数据频率表示。运用夏皮罗-威尔克（Shapiro-Wilk）法对数据的分布特征进行分析。两组间比较采用非配对Student t检验或Mann-Whitney U检验。多组间比较采用one way ANOVA或Kruskal-Wallis检验，在适当的时候使用Bonferroni校正多组间比较。对于分类变量，通常采用卡方检验或Fisher精确检验。采用斯皮尔曼相关系数，研究miRNA的水平和其他变量之间的相关关系。利用受试者工作特征（ROC）曲线分析来评估各miRNA诊断试验的准确性。应用ROC曲线下面积（AUC）对相关诊断试验进行评价和比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1研究对象的基线临床资料

30例急性STEMI患者在胸痛发作后平均（3.5 ±2.9）h内入院。急性STEMI患者的平均年龄为（63.6±11.3）（44～89岁），UAP患者的平均年龄为（64.8±8.8）岁（51～82岁），健康对照组的平均年龄为（35.6±12.8）岁（22～59岁）。急性STEMI患者的生物标志物，如白细胞、葡萄糖、cTnI、CK、CK-MB、低密度脂蛋白/高密度脂蛋白比值等均明显高于UAP组和健康对照组（均为P＜0.05），见表1。

2.2急性STEMI患者血浆miR208a、miR208b表达水平

两个心脏富集miRNA在急性STEMI、UAP和健康对照组均可测得。急性STEMI患者miR208a、miR208b表达水平显著高于健康对照组，分别是健康对照组的9.45倍（P＜0.001）和10.43倍（P＜0.001）（图1）。此外，UAP患者心脏富集miR208a、miR208b表达水平也显著高于健康对照组，分别是健康对照组的4.35倍（P＜0.001）和2.5倍（P＜0.001）（图1），而其cTnI和CK-MB水平并未升高。急性STEMI与UAP组的两个miRNA表达水平之间差异有统计学意义（均为P＜0.05）。

对急性STEMI（n=14）和UAP（n=9）患者入院后（16.3±5.3）h后的血浆miR208a、miR208b表达水平进行了测定，结果显示两个miRNA表达水平较入院时相比显著下降（均为P＜0.05），miR208b表达水平降至接近于健康对照组（图2A和2B）。

2.3血浆中miR208a和miR208b的表达量与cTnI的相关性

19例急性STEMI患者胸痛发作3 h内，miR208a表达水平均出现升高现象（100%），89.5%（17例）患者miR208 b表达水平升高，而仅有47.4%（9例）患者的cTnI呈阳性。症状发作超过3 h后，急性STEMI患者的这些miRNA和cTnI均呈阳性升高。相关分析显示miR208a与cTnI呈明显正相关（Spearman's rho=0.449，P=0.01），miR208b则与cTnI未显示明显相关（Spearman's rho=0.295，P=0.058）。

表1　研究对象的临床特征

图1　健康对照组、急性STEMI及UAP患者血浆中miR208a、miR208b的表达水平；图2　入院时与入院次日早晨 A：miR208a、B：miR208b的表达水平

2.4miR208a和miR208b的诊断准确率

通过ROC曲线对miR208a和miR208b的诊断准确率进行了分析。ROC分析数据来自全部71例患者。急性STEMI组miR208a、miR208b的ROC曲线与健康对照组有非常明显的区别，其曲线下面积（AUC）分别为0.97（95%CI：0.937～1.011，P＜0.001）和0.938（95%CI：0.867～1.010，P＜0.001）（图3A和3B）。结果表明，miR208a和miR208b对急性STEMI诊断具有高度的敏感性和特异性。

图3　通过ROC曲线分析评估miR208a、miR208b的诊断准确性；A：miR208a的ROC曲线；B：miR208b的ROC曲线；图4　急性STEMI与UAP患者miRNAs（miR208a和miR208b）及cTnI的ROC曲线

在区分急性STEMI患者和UAP患者方面，cTnI具有良好的准确性（AUC=0.900）。而miRNAs没有达到一个理想化的AUC值［miR208a的AUC值=0.739（95%CI：0.582～0.896）。miR208b的AUC值=0.750（95%CI：0.600～0.900）］可以用于急性STEMI患者和UAP患者的鉴别诊断（图4）。

3　讨论

目前为止，在人体内发现的miRNA达1 900多种［4］，且有些miRNA在人体中广泛分布，而有一些只在特定的细胞和组织内表达。在心脏内检测出的miRNA已超过200多种，其中大约有20多种miRNA被认为是可能潜在的AMI诊断标志物［5-6］。miR208家族包括miR208a和miR208b，该两种miRNA的编码基因位于肌球蛋白重链基因，并且均在心脏中高表达，其中miR208b在骨骼肌中也呈高表达［7-9］。

本研究旨在通过检测血浆心肌特异性miR208a、miR208b的表达水平，确立它们作为AMI早期诊断标志物的潜在作用。我们的结果显示，急性STEMI患者的循环miR208a、miR208b与健康对照组相比有显著的升高（图1），入院（16.32± 5.25）h后，血浆水平基本恢复到基线水平（图2）。急性STEMI患者胸痛发作3 h内，miR208a表达水平的升高率达100%，miR208b表达水平的升高率达89.5%，而住院患者cTnI呈阳性的比率仅有47.4%。我们应用ROC曲线分析了两个心肌特异性循环miRNA的诊断价值，结果显示循环miR208a和miR208b在AMI的早期诊断方面均具有敏感性和心肌特异性（分别为AUC=0.974和AUC= 0.938），提示miR208a和miR208b可以作为早期诊断AMI的生物标志物。

我们的结果显示，miR208a和miR208b表达水平在UAP组中有轻微升高，而cTnI和CK-MB的水平则无上升。但不能排除轻度心肌损伤引起轻微升高的可能，当然也不能排除这些miRNA可能因具有心肌保护功能，而导致表达量轻微上升的可能性。但这些miRNA在UAP与AMI患者之间进行鉴别诊断的作用可能是有限的。ROC曲线显示，miR208a、miR208b在急性STEMI和UAP组之间进行鉴别诊断的价值有限，AUC分别为0.739和0.750，而cTnI则显示出良好的准确性（AUC=0.900）（图4）。

以往的研究通常以人类和啮齿类动物作为研究对象，主要研究AMI患者和动物miR-1，miR-133a，miR-133b和miR-499等循环miRNAs的表达水平升高的现象［10-11］。但这些miRNA不仅仅在心肌细胞中表达，而且在骨骼肌中也可检测到。因此，骨骼肌的损伤也可导致上述miRNAs表达水平上调。

关于循环心脏特异性miRNAs（miR208a和miR208b）和AMI的相关研究有着显然不同的研究结论［10-11］。有学者认为，miR208a和（或）miR208b在人体心脏中高表达［7］，大约在90%的AMI患者中有升高现象［12］，大约在接近89%的健康对照组中无法检测到，这表明miR208a和miR208b可能是一个很好的AMI诊断标志物［10］。与此相反，一些报告表明miR208a和miR208b在人体心脏中低表达［13］，循环miR208则几乎检测不到，仅在少数AMI患者中出现［14］，且从未在健康对照者中出现，miR208a和miR208b认为不适合作为人类心肌损伤标志物［11］。不同研究结果之间的差异可归因于检测方法上的差异，以及内参基因和样本质量上的差别。

由于样本规模较小，本研究有一定的局限性。本研究不包括非STEMI、稳定型心绞痛及心力衰竭患者。健康对照组主要由年轻人组成，平均年龄为（35.6±12.8）岁，与ACS组存在年龄偏倚，但是由于ACS的发病机制不同，对于结果的分析仍然有临床参考意义。循环心肌特异性miR208a和miR208b可能是早期诊断人类急性心肌梗死的潜在的生物标志物。但还需要大样本的设计合理的规范化研究对循环miRNAs作为AMI诊断标志物的价值做进一步研究。

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Early diagnostic value of circulating microRNA208a，208b in acute myocardial infarction

Oyunbileg O，Li Guangping，Wang Xinghua，Xu Zhao.Department of Cardiology，Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin Key Laboratory of Ionic and Molecular Function of Cardiovascular Disease，Tianjin 300211，China

Li Guangping，Email：tjcardiol@126.com

Objective To investigate the early diagnostic value of specific miR208a，miR208b in acute myocardial infarction（AMI）.Methods A total of 30 patients with acute ST segment elevation myocardial infarction（STEMI），20 unstable angina pectoris（UAP）and 21 normal subjects were enrolled. Using hs-nRNA U6 as reference，miR208a and miR208b expressions were measured by SYBR qRT-PCRs. miR208a，miR208b expressions and cTNI determined in venous blood samples within 12 h after onset of AMI，first sample taken at admission and second sample at 6 am next morning.Results miR208a and miR208b expressions were significantly higher in patients with STEMI than in healthy subjects by about 9.45 times and 10.43 times（both P＜0.001），respectively.miRNAs'expressions in UAP patients were increased slightly.Within the first 3 h after episode，the expressions of miR208a and miR208b in patients with acute STEMI were increased in 100%（19/19）and 89.5%（17/19）of the patients，respectively. Meanwhile，cTnI positive occurred only in 47.4%（9/19）of the patients.There was a significant difference in miR208a and miR208b expressions between STEMI patients and healthy controls.The area under curve（AUC）was 0.97（95%CI：0.937-1.011，P＜0.001）and 0.938（95%CI：0.867-1.010，P＜0.001）respectively.The AUC of miR208a and miR208b was 0.739 in acute STEMI and 0.750 in UAP.However，the AUC of cTnI was 0.900.Conclusions Plasma miR208a and miR208b act as potential biomarkers for the early and accurate diagnosis of AMI.The differential diagnostic efficacy of miR208a and miR208b for STEMI and UAP are lower than cTnI.

Myocardial infarction； Circulating microRNA； Biomarker； miR208a； miR208b

2014-06-15）

（本文编辑：周白瑜）

10.3969/j.issn.1007-5410.2015.01.004

300211天津医科大学第二医院心脏科，天津市心血管病离子与分子重点实验室

李广平，电子信箱：tjcardiol@126.com