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西格列汀诱导糖尿病大鼠肾脏表达血红素氧合酶

2015-10-21胡兰余敏君胡新年江涛刘莎王建平

延边医学 2015年26期
关键词:血红素列汀西格

胡兰 余敏君 胡新年 江涛 刘莎 王建平

摘要:目的:观察西格列汀诱导糖尿病大鼠肾脏表达血红素氧合酶-1(HO-1)表达的影响。方法 : 选取SPF级雄性SD大鼠40只,给予高糖高脂饲料喂养4周,随后模型组大鼠采STZ(30mg/kg)腹腔注射以建立糖尿病肾病大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为对照组(n=10)、低剂量[1mg/(kg·d),n=10]和高剂量[10mg/(kg·d),n=10]西格列汀干预组,10周后,获取大鼠肾组织,Western blot检测HO-1蛋白表达水平,实时定量PCR检测mRNA表达,比色法分析HO-1酶活性。结果:与阴性对照组相比,模型组大鼠中HO-1蛋白表达水平、mRNA水平以及HO-1酶活性有轻度增高。而采用不同浓度的西格列汀干预后HO-1蛋白表达水平、mRNA水平以及HO-1酶活性进一步增加,并呈一定的剂量依赖性。结论:西格列汀能上调糖尿病大鼠肾脏表达HO-1。

关键词: 西格列汀;红素氧合酶-1;糖尿病

糖尿病肾病是糖尿病最常见的慢性并发症之一,是导致终末期肾衰竭的重要原因。其发病机制十分复杂,目前大量的证据表明糖尿病引起的氧化应激与糖尿病慢性并发症的发生发展密切相关。生理条件下,机体在应对氧化应激产生的活性氧(ROS)损害时形成了一套复杂的抗氧化应激应答防御系统,即当暴露于ROS时,机体自身能通过诱导表达一系列保护性蛋白,来缓解组织细胞遭受的损害。血红素氧合酶(heme oxygenase,HO)-1是血红素降解的起始酶以及限速酶,是一种具有拮抗氧化应激作用的抗氧化酶,是细胞氧化应激过程中的一个敏感指标。在生理状态下,肾脏中仅肾髓质低水平表达HO-1,但在糖尿病等病理状态下,HO-1受诱导表达水平增高,从而发挥抗氧化、抗炎症的效应。近年来有研究发现西格列汀具有潜在的大血管保护作用,为糖尿病大血管病变的防治开辟了新的治疗途径。研究显示西格列汀可通过激活环磷酸腺苷途径减少AGE的形成,抑制NF-κB的激活,以减少血管内皮细胞炎症因子的表达,来发挥血管保护作用。本实验利用高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素腹腔注射的方法建立糖尿病肾病大鼠模型,观察西格列汀对HO-1表达的有何影响,从而探討其对血管保护作用的可能机制。

1材料与方法

1.1主要实验材料

链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司,TRIZol 购自Invitrogen 公司;cDNA逆转录试剂盒从Fermentas公司购买;血红素氧合酶-1活性试剂盒上海GENMED公司;RIPA裂解液、ECL试剂盒购自Thermo;鼠抗人HO-1购自Cell Signaling。

1.2 模型的建立

65只健康清洁级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,3月龄,体重180-220g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。实验前于一般饲料条件下喂养大鼠l周以适应环境,测量大鼠血糖保证其在正常的范围内。随机选取15只大鼠作为正常对照组(NC组),给予NC组普通饲料喂养直到研究结束。剩下的50只大鼠用作糖尿病造模组,给予高糖高脂的饲料(普通饲料加入10%熟猪油、10%蔗糖、0.2%胆酸钠、2%胆固醇)共4周(每日热量不限)。在造模组和正常组中各随机取出15只大鼠,称重后将其禁食12h,于大鼠的右眼眶后静脉丛进行取血,取1.5~2ml置于4℃的条件下进行自然凝聚。随后以3000rpm离心5min,移取上清液进行空腹胰岛素和空腹血糖检测,计算出胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),确认造模组的大鼠产生胰岛素抵抗以后,对其进行禁食,12h后通过腹腔内注射给予链脲佐菌素(STZ),剂量是30mg/kg,在冰浴下用0.1mmol/L的无菌的枸橼酸钠缓冲液配制1%STZ溶液,并将其调为PH4.4,于4℃条件下保存,注意要现用现配。为正常组大鼠腹腔注射对应体积的无菌枸橼酸钠缓冲液。72h后对大鼠行尾静脉取血以检测血糖,若血糖浓度不足16.7mmol/L,再次对其腹腔内注射STZ,20mg/kg。若大鼠不同日的三次随机血糖浓度不低于16.7mmol/L,将其选为糖尿病模型。进行眶内静脉取血操作时,有2只造模组大鼠由于麻醉及取血操作的问题死亡,还有1只大鼠造模失败,最后共有47只大鼠糖尿病造模成功。

1.3 HO-1蛋白表达检测

模型建立10周后处死大鼠,获取肾脏组织并制成匀浆,加入含蛋白酶抑制剂的裂解液充分裂解组织,4℃ 12,000 rpm离心10 min,获取上清用于实验。细胞总蛋白的提取试剂盒严格按照说明书使用。将前面提取出的蛋白进行蛋白定量以后,取等量蛋白裂解液于10%-12%的SDS-PAGE上进行电泳及转膜,然后置于5%无脂奶粉中,进行封闭1h,再加入适当稀释比例的一抗于4℃条件下孵育过夜,加适量稀释的二抗于37℃条件下孵育1h,用ECL试剂进行显影。

1.4 HO-1 mRNA表达分析

用TRIzol试剂提取细胞总RNA,并取3μg的RNA进行逆转录。引物信息如下:HO-1上游引物:5- CGTGCAGAGAATTCTGAGTTC -3′,HO-1下游引物: 5′- AGACGCTTTACGTAGTGCTG -3′; β-actin上游引物: 5′- CCTGTATGCCTCTGGTCGTA -3′, β-actin下游引物: 5′- CCATCTCTTGCTCGAAGTCT -3′,将获得的转录产物cDNA进行Realtime-PCR。定量PCR扩增程序如下:50℃ 2 min,随后进入95℃10 min,最后进行95℃ 15 s,58℃ 1 min共40个循环,结果以相对表达量表示。

1.5 HO-1酶活性分析

将获取的组织上清至1.5 mL的EP管中(可分多次收集),1,000 rpm离心8 min,弃上清,加1.5 mL的GENMED清理液A去清洗细胞,1,000 rpm离心8 min,弃上清,沥干,将EP管放置冰上,加入100 μL GENMED裂解液B,充分混匀,超声裂解细胞,(超声条件:振幅14 nm,10 s,间隔15 s,重复3~5次)。最后将裂解液置于4℃,10,000 rpm离心15 min,吸取上清放置另一新的EP管中,按照试剂盒提供的操作步骤,计算出血红素氧合酶-1的活性,结果以相对活性表示(模型组活性/对照组活性×100%)。

1.6统计学方法

所有数据均采用±SD表示,并采用One-Way ANOVA方法对数据进行统计分析。P<0.05认为具有统计学意义。

2结果

2.1 西格列汀对HO-1蛋白表达的影响

西格列汀对HO-1蛋白表达的影响见表1。

表1 西格列汀对HO-1蛋白表达的影响

与阴性对照组相比,模型组大鼠中HO-1蛋白表达水平有一定提高。用高剂量西格列汀干预后,HO-1蛋白表达水平比低剂量西格列汀干预组进一步增加,呈一定的剂量依赖性。

2.2 西格列汀对HO-1 mRNA表达的影响

西格列汀对HO-1 mRNA表达的影响见表2。

表2 西格列汀对HO-1 mRNA表达的影响

与阴性对照组相比,模型组大鼠中HO-1 mRNA表达水平有一定提高。用高剂量西格列汀干预后,HO-1 mRNA表达水平比低剂量西格列汀干预组进一步增加,呈一定的剂量依赖性。

2.3西格列汀对HO-1酶活性的影响

西格列汀对HO-1酶活性的影响见表2。

表2 西格列汀对HO-1酶活性的影响

与阴性对照组相比,模型组大鼠中HO-1酶活性有一定提高。用高剂量西格列汀干预后,HO-1酶活性比低剂量西格列汀干预组进一步增加,呈一定的剂量依赖性。

3讨论

糖尿病是一种常见的代谢疾病群,糖尿病的并发症有100多种,是目前已知疾病当中并发症最多的,糖尿病肾病是糖尿病最常见的慢性并发症之一,是导致终末期肾衰竭的重要原因[1]。胰岛素作用缺陷或(和)胰岛素分泌缺陷导致高血糖。高血糖和继发的脂代谢紊乱会导致糖尿病患者体内产生的活性氧簇(reactive oxygen species ,ROS)增多,同时机体清除活性氧簇系统的功能降低,氧化级抗氧化功能间失衡[2]。生理條件下,机体在应对氧化应激产生的活性氧(ROS)损害时形成了一套复杂的抗氧化应激应答防御系统,即当暴露于ROS时,机体自身能通过诱导表达一系列保护性蛋白,来缓解组织细胞遭受的损害[3]。目前,拮抗氧化应激在糖尿病慢性并发症的防治方面具有重大意义。

血红素氧合酶(heme oxygenase,HO)-1是血红素降解的起始酶以及限速酶,是细胞氧化应激过程中的一个敏感指标[4]。在生理状态下,肾脏中仅肾髓质低水平表达HO-1,但在糖尿病等病理状态下,HO-1受诱导表达水平增高,从而发挥抗氧化、抗炎症的效应[5]。糖尿病患者的肾组织中产生的ROS过多,HO-1受到较强的诱导[6]。本研究利用高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素腹腔注射的方法建立糖尿病肾病大鼠模型。糖尿病动物模型包括人工诱发以及遗传自发两类,人工诱发是指为四氧嘧啶(alloxan)或大鼠注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)等药物诱导其产生糖尿病[7]。STZ对动物胰岛B细胞的损害存在较高的特异性,故广泛应用于糖尿病动物模型的复制。

近年来有研究发现西格列汀具有潜在的大血管保护作用,为糖尿病大血管病变的防治开辟了新的治疗途径,西格列汀可通过激活环磷酸腺苷途径减少AGE的形成,抑制NF-κB的激活,以减少血管内皮细胞炎症因子的表达,来发挥血管保护作用[8]。本研究以糖尿病肾病大鼠模型为研究对象,观察西格列汀对HO-1表达的有何影响。结果表明:与阴性对照组相比,模型组大鼠中HO-1蛋白表达水平、mRNA水平以及HO-1酶活性有轻度增高。而采用不同浓度的西格列汀干预后HO-1蛋白表达水平、mRNA水平以及HO-1酶活性进一步增加,并呈一定的剂量依赖性。有研究表明,HO-1上调可以使得胰岛素抵抗改善,血清脂联素的水平提高,胰岛素敏感性增强,肝脏 MDA 水平减少,HO-1上调具有抗糖尿病的功效[9]。HO-1可以有效抗氧化,它能够增强过氧化氢酶以及细胞外超氧化物歧化酶的活性,降低上皮细胞的凋亡,减少超氧阴离子形成[10]。

综上所述,西格列汀能上调糖尿病大鼠肾脏表达HO-1,对糖尿病的治疗具有一定意义。

参考文献:

[1]翁建平. 对糖尿病流行病学、循证医学及基础研究的探索[J]. 中山大学学报(医学科学版),2010,02:166-171+178.

[2]宋文春. 2型糖尿病患者血清UCP-1、ROS与胰岛素抵抗和糖尿病血管并发症的相关性研究[D].苏州大学,2014.

[3]陈燕,黄苏萍. ROS、SOD、GSH在糖尿病血管病变中的研究近况[J]. 江西中医学院学报,2013,03:93-97.

[4]邢邯英,凌亦凌. 血红素氧合酶与糖尿病[J]. 中国动脉硬化杂志,2006,10:914-916.

[5]赵丽. Nrf2/HO-1途径对高脂饮食诱导的大鼠胰岛素抵抗的保护作用和机制研究[D].第四军医大学,2012.

[6]王飞. 益气养阴化瘀通络中药对糖尿病胃轻瘫大鼠SOD、MDA、HO-1及Bcl-2与Bax基因表达的影响[D].河北医科大学,2014.

[7]谢宁,吴颂,王晓博,关慧波,侯淑峰. 糖尿病动物模型研究进展[J]. 新乡医学院学报,2007,06:629-632.

[8]聂小艳. 西格列汀对大剂量胰岛素治疗的2型糖尿病患者各项指标的影响[D].吉林大学,2014.

[9]李健. 上调血红素氧合酶1对糖尿病心肌梗死大鼠心功能的远期影响[D].中国人民解放军医学院,2012.

[10]张雨婷. HO-1与脂代谢在妊娠期糖尿病中的表达及相关性研究[D].河北医科大学,2014.

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