羧甲基壳聚糖糖用澄清剂的制备及结构表征

何惠欢，谢志荣，刘继栋，梁欣泉，*

（1.广西工业职业技术学院，广西南宁530001；2.南宁糖业股份有限公司明阳糖厂，广西南宁530227；3.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

羧甲基壳聚糖糖用澄清剂的制备及结构表征

何惠欢1，谢志荣2，刘继栋3，梁欣泉3，*

（1.广西工业职业技术学院，广西南宁530001；2.南宁糖业股份有限公司明阳糖厂，广西南宁530227；3.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁530004）

为了研究取代SO2的新型糖用澄清剂，以壳聚糖（CTS）为原料、氯乙酸（CA）为改性剂，采用微波辐射技术制备羧甲基壳聚糖。以该产物对蔗汁澄清的脱色率和纯度差为评价指标，优化制备条件，使用扫描电镜（SEM）、红外光谱仪（FT-IR）及核磁共振（1H-NMR）分析产物性能及表征结构。结果表明，在mNaOH∶mCTS=5∶1，微波功率600W，辐射时间12min，mCA∶mCTS=6∶1条件下，所制备的羧甲基壳聚糖为N，O-羧甲基壳聚糖，水溶性得到改善、对蔗汁中带电胶体的吸附范围及电中和性能有所增加；其对蔗汁澄清的脱色率和纯度差分别达50.45%和1.63%，通过对比亚硫酸法澄清工艺的实际生产数据，认为羧甲基壳聚糖可以取代SO2作为糖用澄清剂应用于蔗汁澄清过程。

氯乙酸，羧甲基壳聚糖，蔗汁，澄清

壳聚糖（CTS）是一种阳离子高分子絮凝剂，具有良好的吸附性和环境友好性，无毒无味，广泛应用于水处理、医药、食品等行业［1-2］。近年来，壳聚糖在糖汁澄清方面的探索研究已取得一些成果［3-5］，但因其只能溶于pH≤3～5的水溶液或乙酸等酸性溶剂中，使之在制糖生产过程中的应用受到了限制。

羧甲基壳聚糖是壳聚糖经羧甲基化改性生成的产物，属于两性高分子聚电解质，可结合水体中带正电荷以及带负电荷的物质，扩大了壳聚糖去除溶液中分子的种类。同时，通过羧甲基改性，可以破坏壳聚糖分子间的氢键，改善水溶性，拓宽其应用范围［6-8］。吴勇［9］，徐云龙［10］报道了羧甲基壳聚糖在环保、食品、医学、化学等领域的应用研究，但应用于制糖过程中的蔗汁澄清未见报道。

微波辐射技术具有反应速度快、产率高、清洁、节能等特点，已成功应用于多种有机反应和高分子合成中［11-12］。因此，本研究采用微波技术，以壳聚糖为原料、氯乙酸（CA）为改性剂制备羧甲基壳聚糖，并以其对甘蔗混合汁澄清的色值、纯度差为评价指标，优化制备条件，开发适合于蔗汁清净的羧甲基壳聚糖用澄清剂；同时，采用电镜扫描（SEM）、红外光谱仪（FT-IR）及核磁共振（1H-NMR）等方法分析羧甲基壳聚糖的性能并表征其结构。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

壳聚糖工业级，实验室测定脱乙酰度为74.54%，浙江金壳生物有限公司；甘蔗混合汁采自南宁明阳糖厂，过200目滤网待用；氯乙酸AR，成都市科龙化工试剂厂；絮凝剂PAM日本T1150；其余所有试剂均为分析纯。

WD900ATL23-2微波炉广东Ganlanz公司；日立S-3400N型扫描电镜日本日立电子有限公司；FT-IR傅立叶红外光谱仪美国PerkinElmer公司；WZZ-T2自动旋光仪上海精密科学仪器有限公司；岛津UV-2501PC紫外分光光度计日本岛津公司；数字式阿贝折光仪日本ATAGO公司。

1.2羧甲基壳聚糖的制备及纯化

1.2.1羧甲基壳聚糖制备称取5g壳聚糖，加入实验用量的40%NaOH溶液和少量十二烷基苯磺酸钠，置于-20℃冰箱中碱化10h。将预先配好的50%氯乙酸-异丙醇溶液在搅拌状态下滴加到碱化后的壳聚糖中，移入微波炉中反应一段时间，冷却至室温，用10%的盐酸溶液调pH至（7.0±0.2），过滤，滤渣用40m L 80%甲醇水反复浸泡洗涤并抽滤3次，再用40m L无水乙醇浸泡洗涤抽滤反复3次，沉淀物在60℃真空干燥至恒重，得到羧甲基壳聚糖产品。羧甲基壳聚糖用蒸馏水配成1%水溶液，用于澄清处理甘蔗混合汁。

1.2.2羧甲基壳聚糖纯化取1.0g羧甲基壳聚糖，加20m L蒸馏水溶解，过滤，滤液用40m L丙酮沉淀；抽滤，再用蒸馏水溶解所得固体物，得到含羧甲基壳聚糖的水溶液；将溶液置于透析袋中透析并定时更换去离子水，24h后对溶液旋转蒸发浓缩；浓缩液用丙酮沉淀处理，抽滤，固体物料在真空干燥至恒重待用。纯化后的羧甲基壳聚糖样品用于SEM、FT-IR、1H-NMR检测。

1.3羧甲基壳聚糖制备工艺实验

1.3.1单因素实验设计考察微波功率、辐射时间、氯乙酸（CA）与壳聚糖的质量比、氢氧化钠与壳聚糖的质量比（质量比均为各种试剂的纯品质量比）等因素的适宜范围，以羧甲基壳聚糖的水溶解性能及其对甘蔗混合汁澄清的色值（IU）、纯度差（△G.P.）为考核指标，评价羧甲基壳聚糖的改性效果。固定mNaOH∶mCTS=5∶1，微波功率400W，辐射时间12m in，mCA∶mCTS=6∶1，研究mNaOH∶mCTS=1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1，微波功率200、400、600、800、1000W，微波辐射时间3、6、9、12、15、18min，mCA∶mCTS=3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1对色值、纯度差的影响。

1.3.2正交实验在单因素实验的基础上，采用L9（34）进行正交实验，以羧甲基壳聚糖对甘蔗混合汁澄清的纯度差和脱色率为评价指标，优化羧甲基壳聚糖的制备工艺条件，因素水平见表1。

表1　正交实验因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test

1.4羧甲基化壳聚糖对甘蔗混合汁的澄清实验

在300m L甘蔗混合汁中加入7.3m L 0.85%的磷酸溶液，用石灰乳调pH（6.6±0.2），加热至50℃，然后添加400mg/L羧甲基壳聚糖溶液（配成1%的水溶液），并在搅拌状态下添加石灰乳中和至pH（7.0±0.1）。取30%的蔗汁用搅拌器机械制泡10s，其余70%的蔗汁加热至90℃，两者混合均匀并添加3mg/L PAM絮凝剂，在水浴80℃保温状态下，上浮清净20m in，取浮清汁分析重力纯度、色值等指标。

1.5纯度、色值的测定及计算

混合汁和清汁的重力纯度、色值的测定方法参照李墉［13］。

纯度差的计算：

纯度差△G.P.=清汁的重力纯度-混合汁的重力纯度

脱色率的计算：

1.6电镜扫描分析用扫描电镜对壳聚糖和羧甲基壳聚糖进行扫描，观察壳聚糖羧甲基化改性后的形貌变化情况。

1.7红外光谱分析对壳聚糖和羧甲基壳聚糖用FT-IR扫描分析。

1.8核磁共振分析羧甲基壳聚糖的1H-NMR分析委托广西测试研究中心测试，用D2O作溶剂。

2　结果及讨论

2.1单因素实验结果分析

2.1.1氢氧化钠与壳聚糖质量比对色值和纯度差的影响由图1可知，清汁色值随着氢氧化钠用量的增加先升后降，当氢氧化钠与壳聚糖比例达4∶1后，色值趋于稳定。纯度差在mNaOH∶mCTS=5∶1时最大。水溶解性方面，可以观察到随着碱用量的增加，羧甲基壳聚糖的溶解度增大，比例为5∶1和6∶1时可完全溶解。综合考虑，选定mNaOH∶mCTS=5∶1。

图1　氢氧化钠与壳聚糖质量比对色值和纯度差的影响Fig.1　Effectof differentmass ratio NaOH and chitosan on purity differences and decolourization ratios

2.1.2微波功率对色值和纯度差的影响从图2可以看出，微波功率为400W时清汁色值最低，功率大于400W时，色值随着功率的增加而增加；在功率200～600W范围时，纯度差相差不大，功率超过600W时，纯度差下降；在功率400～600W范围内，羧甲基壳聚糖水溶解性较好，而在功率为800～1000W时，羧甲基壳聚糖由浅白色变为黄色，呈现焦化趋势。因此，选择微波功率为400W。

图2　微波功率对色值和纯度差的影响Fig.2　Effectof differentmicrowave power on purity differences and decolourization ratios

2.1.3微波辐射时间对色值和纯度差的影响由图3可知，随着辐射时间的增加，清汁色值先降后升，12m in时，色值最低；纯度差总体呈增加趋势，达到9m in后纯度差增加不多；羧甲基壳聚糖的水溶性随着辐射时间的增加而逐渐增大，达到9m in之后，溶解性能良好。因此，认为微波辐射时间12m in为宜。

图3　微波辐射时间对色值和纯度差的影响Fig.3　Effectofmicrowave irradiation time on purity differences and decolourization ratios

2.1.4氯乙酸与壳聚糖质量比对色值和纯度差的影响实验中可观察到，氯乙酸与壳聚糖质量比在3∶1～7∶1范围内，羧甲基壳聚糖的水溶性能均较好。由图4可以看出，在mCA∶mCTS=8∶1时清汁色值最低，但纯度差较小；在mCA∶mCTS=4∶1时，纯度差最大，但色值较高；考虑到本实验是在尽可能提高纯度的基础上取得最好的脱色效果，故选择mCA∶mCTS=5∶1。

图4　氯乙酸与壳聚糖质量比对色值和纯度差的影响Fig.4　Effectof differentmass ratio CA and chitosan on purity differences and decolourization ratios

2.2正交实验结果分析

在单因素实验基础上，采用L9（34）进行正交实验，以羧甲基壳聚糖对甘蔗混合汁澄清的脱色率和纯度差为评价指标，对羧甲基壳聚糖制备工艺条件进行优化，结果见表2。

表2　正交实验结果Table 2　Results of orthogonal test

表3　脱色率正交实验结果方差分析Table 3　The variance analysis of decolourization ratios

表4　纯度差正交实验结果方差分析Table 4　The variance analysis of purity differences

由表2极差分析可知，影响脱色率的因素主次顺序为：C＞B＞D＞A，其最佳工艺条件为：A2B3C2D2；影响纯度差的因素主次顺序为：B＞D＞A＞C，其最佳工艺条件为：A2B2C3D2。由表3、表4方差分析结果可知，4个因子对两个指标的影响均不显著。

2.3验证实验及展望

以正交实验结果得出的最佳组合条件A2B3C2D2和A2B2C3D2分别进行三次验证实验。A2B3C2D2条件下得到脱色率和纯度差的平均值分别为50.45%和1.63%；A2B2C3D2条件下得到脱色率和纯度差的平均值分别为48.62%和1.61%。对比两组数据，故确定羧甲基壳聚糖制备最佳工艺条件为：A2B3C2D2，即mNaOH∶mCTS=5∶1，微波功率600W，辐射时间12m in，mCA∶mCTS=6∶1。

目前，我国90%以上的甘蔗糖厂采用亚硫酸法澄清生产工艺，以SO2为主要的澄清剂和脱色剂处理甘蔗混合汁，脱色率和纯度差的实际生产数值一般为20%～50%和0.5%～1.5%［14］。由上述验证实验结果可知，羧甲基壳聚糖作为澄清剂澄清处理甘蔗混合汁，脱色率和纯度差分别达50.45%和1.63%。因此，使用羧甲基壳聚糖作为糖用澄清剂处理蔗汁完全可行，但其应用工艺还需进一步研究探索，以期开发出无硫糖生产新工艺。

2.4壳聚糖和羧甲基壳聚糖的SEM表征

图5为壳聚糖和羧甲基壳聚糖的电镜扫描图。由图5可见，壳聚糖表面相对平整光滑，而改性后的羧甲基壳聚糖表面微观形态发生了较大变化，表面粗糙，部分分子连结一起成为不规整的纤维状，并呈现为纵横交错的网状结构。这种结构的形式增加了羧甲基壳聚糖分子颗粒的表面积，有利于提高吸附、网络、捕集蔗汁中非糖杂质颗粒的能力，并借助羧甲基壳聚糖分子长链的架桥作用，使蔗汁中的胶体、色素等杂质得以卷扫清除，从而获得较好的澄清效果。

图5　壳聚糖和季铵化壳聚糖的电镜扫描（SEM）图（×1000）Fig.5　The SEM picture of chitosan and carboxymethyl chitosan（×1000）

2.5壳聚糖和羧甲基壳聚糖的FT-IR表征

壳聚糖和羧甲基壳聚糖的FT-IR图见图6。由图6可以看出，壳聚糖羧甲基化改性前后的红外谱图相似，但也存在一定差别。壳聚糖红外谱图中，在1651.01cm-1有一强度不大的酰胺I谱带（N-H）变形振动峰，而在羧甲基壳聚糖的图谱中则在1591.3cm-1和1417.98cm-1分别出现很强的-COO-不对称和对称伸缩振动的吸收峰，这两个吸收峰均为羧酸盐的特征吸收峰；并且在1320.06cm-1附近的酰胺Ⅱ谱带也发生了红移且强度增加，该结果与文献［15-17］报道的相关数据基本一致，表明了改性后的壳聚糖发生了羧甲基化反应，引进了羧甲基团。羧甲基壳聚糖由于引进了亲水性的羧甲基团，使其水溶性得到较大改善，无需在酸性条件下溶解，避免了使用时因在蔗汁中加入酸性溶液而引起的糖分损失。

图6　壳聚糖与羧甲基壳聚糖FT-IR曲线比较图Fig.6　Compare chitosan and carboxymethyl chitosan on FT-IR spectrum

图7　羧甲基壳聚糖的1H-NMR图Fig.7　1H-NMR spectrum of carboxymethyl chitosan

2.6羧甲基壳聚糖的1H-NMR表征

羧甲基壳聚糖的1H-NMR图见图7。图7中，在δ= 4.821mg/L处出现了典型的C6位取代的羧甲基中的H最大吸收峰（-OCH2COOD），而在δ=3.944mg/L处则出现了典型的C2位取代的羧甲基中的H吸收信号峰（-NDCH2COOD），同时可看到δ=4.821mg/L的峰面积明显高于δ=3.944mg/L处的峰面积。这说明得到的羧甲基壳聚糖为N，O-羧甲基壳聚糖且以O-取代为主，相关数据与文献［18-20］报道的基本一致。N，O-羧甲基壳聚糖不但引进了亲水性的羧甲基基团，改善了水溶性，同时还保留了氨基基团，使之既带有阴离子电荷，也带有阳离子电荷，增加了羧甲基壳聚糖对蔗汁中带电胶体的吸附范围和电中和性能，提高了清净效能。

3　结论

采用微波辐射技术，以壳聚糖为原料、氯乙酸（CA）为改性剂制备羧甲基壳聚糖的工艺条件为：mNaOH∶mCTS=5∶1，微波功率600W，辐射时间12min，mCA∶mCTS=6∶1，此时甘蔗混合汁的脱色率和清混汁纯度差分别达50.45%和1.63%；通过对比亚硫酸法澄清工艺的实际生产数据，认为羧甲基壳聚糖可以取代SO2作为糖用澄清剂。

通过SEM、FT-IR和1H-NMR分析，可以确定改性后的壳聚糖发生了羧甲基化反应，反应产物为N，O-羧甲基壳聚糖。改性后的羧甲基壳聚糖改善了水溶性，增加了羧甲基壳聚糖对蔗汁中带电胶体的吸附范围和电中和性能，提高了对蔗汁的澄清效能和适用性。本研究为探索无硫糖生产新工艺提供依据。

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Preparation and structural characterization of carboxymethyl chitosan as a sugar cane juice clarifying agent

HE Hui-huan1，XIE Zhi-rong2，LIU Ji-dong3，LIANG Xin-quan3，*
（1.Guangxi Vocational&Technical Institute of Industry，Nanning 530001，China；2.Mingyang Sugar Mill of Nanning Sugar Industry Ltd.，Nanning 530227，China；3.Institute of Light Industry and Food Engineering，GuangxiUniversity，Nanning 530004，China）

To p repare a new c larifying agent instead of SO2in sugarcane industry，carboxymethyl chitosan was p repared in this study using chloroacetic acid（CA）as a modifier and chitosan（CTS）as raw material under treatment ofm icrowave radiation.Op timal p reparation cond itions of carboxymethyl chitosan were evaluated by the decolourization ratios and the purity d ifferences to cane juice c larification，and the p roductwas analyzed by scanning electron m icroscope（SEM），infra-red spectrum（FT-IR）and nuc learmagnetic resonance（1H-NMR）. The results indicated that under treatment of mNaOH∶mCTS=5∶1，m icrowave power 600W，treatment time 12m in，mCA∶mCTS=6∶1，the p roduct was p roved to be N，O-carboxymethyl chitosan，and its water-solubility，adsorp tion range of charged colloids in cane juice and the electricity neutralization were all imp roved.The decolourization ratio and the purity d ifference of the new c larifying agentused in cane juice c larification were 50.45%and 1.63%，respectively.According to data obtained from sulfitation p rocess，the results indicated that carboxymethyl chitosan could rep lace SO2in cane juice c larification.

chloroacetic acid；carboxymethyl chitosan；cane juice；c larification

TS244.2

A

1002-0306（2015）06-0117-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.018

2014-06-18

何惠欢（1967-），女，本科，副教授，研究方向：糖品过程强化理论与技术。

梁欣泉（1966-），男，博士，高级工程师，研究方向：糖品过程强化理论与技术。

广西科技厅科技开发计划项目（桂科重1348002-3）；广西教育厅高校科研项目（LX2014609）。