基于Fe3O4@SiO2-MIPs富集/表面增强拉曼光谱检测孔雀石绿的研究

钟坚海，张艳燕，陈金凤,*，张晓龙，杨黄浩，尹晓斐

（1.龙岩出入境检验检疫局，福建龙岩364000）

（2.福州大学化学学院，福建福州350108）

（3.国家海洋局第一海洋研究所，山东青岛266061）

0 引言

分子印迹聚合物作为一种新型、高效的分子识别材料，除了具有优越的特异识别性和高效的选择性，还具有制备简单、成本低廉、功能预构、坚固耐用等特点，尤其适用于复杂体系中目标化合物的选择性分离与分析[1-5]。磁性分离是通过磁场的作用将磁性组分与非磁性组分进行分离的一种技术。近年来，将分子印迹与磁性分离技术相结合日益成为研究热点，通过制备磁性分子印迹聚合物，从而得到兼具磁性快速分离和分子识别特性的材料，目前该技术已应用于雌激素、除草剂、甲硝唑、双酚A等物质的分离富集[6-12]。

拉曼光谱是一种非接触性、非破坏性、样品量少且不受分析物物理形态影响的分析方法，能够方便确定离子和分子的种类，但其存在检测灵敏度低的缺点。近年来，研究发现以金属纳米粒子为活性基底，目标分子附着到金属纳米结构上可得到强烈的拉曼信号增强现象，称为表面增强拉曼散射(SERS)。通过表面增强拉曼散射作用，可以使检测灵敏度提升4至10个数量级，是目前分析化学研究前沿的热点领域[13-16]。

孔雀石绿(MG)作为一种工业染料，易通过工业废水的排放直接或间接的污染养殖区域，并在水产品中聚集。研究发现MG及其代谢产物均具有高残留及高毒性，易产生致癌、致畸及致突变等作用[17]。因此，研究开发养殖水及水产品中MG的富集检测新技术具有非常重要的意义[18-21]。

该文将分子印迹与磁性分离技术相结合，制备获得兼具富集与分离的磁性分子印迹聚合物，并结合纳米银胶体的表面拉曼增强作用，建立了便携式拉曼光谱仪对孔雀石绿的现场快速检测方法，为水体和水产品中MG的快速灵敏检测提供了新方法，具有广阔的推广应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

便携式拉曼光谱仪 （美国DeltaNu公司），红外光谱仪（美国Thermo公司），X-射线衍射仪（日本Rigaku公司），透射电子显微镜 （美国FEI公司），ZHWY-103D恒温培养振荡器 （上海智城分析仪器制造有限公司），温控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），真空干燥箱（上海精密实验设备有限公司），超纯水系统（美国Millipore公司）。

聚乙二醇 (PEG)、四乙氧基硅烷 (TEOS)、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS)、甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基双丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)及其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；孔雀石绿(MG)、结晶紫 (CV)和隐性孔雀石绿 (LMG)购于上海晶纯生化科技股份有限公司；实验用水均为超纯水。

1.2 磁性纳米粒子的合成及表面修饰

采用水热法合成 Fe3O4纳米粒子(Fe3O4NPs)[22]。具体方法如下：称取 1.35 g FeCl3·6H2O，加入40 mL乙二醇，搅拌溶解得到黄色透明溶液。往该溶液中加入3.60 g醋酸钠和0.10 g PEG，搅拌30 min，将溶液移至50 mL带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜内，200℃加热反应10 h。冷却至室温，磁铁分离，黑色颗粒依次用超纯水和无水乙醇各洗涤6遍，60℃条件下真空干燥至恒重，即得到Fe3O4NPs。

称取0.7 g Fe3O4NPs依次加入150 mL乙醇和7.5 mL浓氨水，室温下超声分散1 h，得到分散溶液。将2.5 mL TEOS和2.5 mL MPS加至10 mL乙醇中混匀作为预混合液，将预混合液滴加至Fe3O4NPs分散溶液，机械搅拌下反应24 h，无水乙醇洗涤6遍，60℃真空干燥至恒重，即得乙烯基修饰的Fe3O4NPs。

1.3 Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)和Fe3O4@SiO2-NIPs的制备

称取 100 mg乙烯基修饰的Fe3O4NPs超声分散于30 mL乙腈中，加入0.5 mL EGDMA，超声混匀。另取91.2 mg MG和66 μL MAA混合于30 mL乙腈中，于冰箱冷藏 12 h，得到复合模板单体溶液。将上述制备的两种溶液混合后，加入20 mg AIBN，超声5 min，通氮除氧10 min。密封后，50℃300 r/min预聚合反应6 h，然后在60℃条件下聚合24 h，最后在85℃下进一步老化6 h。制得的Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)用乙腈洗涤至上清液透明，再用甲醇-乙酸溶液(9∶1,V/V)索氏提取72 h。最后，产物用甲醇洗涤数次至中性，60℃下真空干燥。Fe3O4@SiO2-NIPs为未加模板分子的磁性分子印迹聚合物，制备方法除不加模板分子外，其他过程与Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)相同。合成原理如图1所示。

图1 Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)合成原理图Fig.1 Schematic illustration for the preparation ofFe3O4@SiO2-MIPs(MG)

1.4 纳米银溶胶的合成

参照文献[23]采用柠檬酸钠还原硝酸银溶液制备纳米银溶胶，具体方法如下：称取36 mg硝酸银溶解于200 mL水中，加热至沸腾，剧烈搅拌下，加入4 mL 1%柠檬酸钠水溶液，反应60 min后，搅拌下冷却至室温。4℃冰箱避光保存。

1.5 实际样品检测

称取 10 mg Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)于 5 mL离心管中，依次加2 mL甲醇和水振荡各1 min，磁性分离，即完成活化，待用。

1.5.1 养殖水中孔雀石绿的分离富集

取10 mL经 0.22 μm滤膜过滤的待测水，加入 Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)振荡 10 min，磁分离，弃清液；加入2 mL超纯水淋洗，磁分离，弃清液；再用200 μL甲醇-乙酸混合溶液(9∶1,V/V)洗脱5 min，收集洗脱液待测。

1.5.2 水产品中孔雀石绿的分离富集

称取5 g虾肉匀浆于50 mL离心管，两次加入15 mL乙腈，超声振荡6 min，6000 r/min离心5 min，收集合并提取液。将提取液分次加至活化后的3 g中性氧化铝柱，收集滤液，并加入 2 mL乙腈淋洗收集。重复上述步骤将收集液再次过柱净化，收集滤液。把滤液移至100 mL梨形瓶，45℃旋转蒸发至约1 mL，加入3 mL超纯水超声振荡提取，收集溶液，再加入2 mL超纯水超声提取并收集溶液。溶液经0.22 μm水相滤膜过滤后，加入Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)振荡 5 min，磁分离，弃清液，再用1 mL超纯水淋洗，最后用200 μL甲醇-乙酸混合溶液(9:1,V/V)洗脱，收集洗脱液待测。

1.5.3 SERS检测实际样品中的孔雀石绿

取 40 μL 纳米银溶胶， 加入 10 μL 0.2 mol/L KBr溶液，再加入 30 μL待测液，混匀。 取 30 μL置于承载凹槽内，激光聚集，拉曼光谱检测（激发波长：785 nm，激光功率：60 mW，积分时间：10 s）。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

图2A表明实验合成的Fe3O4是高度球形的核-壳粒子，粒径约200～300 nm。当修饰上SiO2和MPS后，在磁珠表面有一层薄壳层（图2B）。由图2C可以明显看到一层20～30 nm的聚合物壳层，证明分子印迹壳层成功包裹在Fe3O4@SiO2表面。此外，没有观察到纯聚合物颗粒和裸露的Fe3O4颗粒，说明印迹聚合反应是在每个Fe3O4纳米颗粒表面进行的。

图2 透射电镜图：(A)Fe3O4，(B)Fe3O4@SiO2，(C)Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)Fig.2 The TEM images of Fe3O4(A),Fe3O4@SiO2(B)and Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)(C)

图3 FT-IR 谱图：(A)Fe3O4，(B)Fe3O4@SiO2，(C)Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)Fig.3 FT-IR spectra of Fe3O4(A),Fe3O4@SiO2(B)and Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)(C)

由FT-IR光谱（图3）可知，三种磁性纳米颗粒在574 cm-1处均有一强吸收峰，此峰归因于Fe-O键的拉伸，这表明在化学修饰和聚合物涂层后Fe3O4的组成没有发生改变；在1254 cm-1处的C-O组峰、1731 cm-1的C=O组峰和2986 cm-1的甲基C-H组峰，表明在磁性颗粒Fe3O4表面已经成功修饰上甲基丙烯酸层。同时，Fe-O拉伸强度逐渐降低(Fe-O:574 cm-1)，这是由于Fe3O4表面存在聚合物壳。

图4 X-射线衍射图：(A)Fe3O4，(B)Fe3O4@SiO2，(C)Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)Fig.4 XRD patterns of Fe3O4(A),Fe3O4@SiO2(B)and Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)(C)

图4为三种磁性纳米颗粒的X-射线衍射图。在10～80°的2θ范围，观察到三个样品的Fe3O4有 6 个特征峰 (2θ =30.38°,35.58°,43.14°,53.48°,57.08°和 62.66°)， 峰位置在相应的 2θ 值分别被索引为 (2,2,0)，(3,1,1)，(4,0,0)，(4,2,2),(5,1,1)和(4,4,0)，这与JCPDS国际衍射数据文件中心(JCPDS Card:19-629)的磁铁矿数据库非常匹配，表明存在合成的高结晶性材料颗粒的特定衍射峰。

2.2 吸附性能

2.2.1 吸附动力学

图5显示，Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)对MG的吸附量在30 min内迅速增加，60 min后基本达到平衡，表明Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)具有良好的传质速度。

图5 Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)的吸附动力学曲线Fig.5 The adsorption kinetics of Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)for 1 μg/mL of MG

2.2.2 饱和吸附容量

从图6可以观察到，Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)对MG的吸附量随着MG初始浓度的增加而增大，较之于Fe3O4@SiO2-NIPs具有更高的吸附量。

图6 Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)和Fe3O4@SiO2-NIPs对孔雀石绿的吸附等温曲线Fig.6 The static adsorption curves of Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)and Fe3O4@SiO2-NIPs to MG

2.2.3 选择性实验

选取与MG具有相似分子结构的CV和LMG进行选择性实验。结果如图7所示，CV、LMG在MIPs上的吸附量明显低于MG，这意味着模板分子比其类似物分子具有更高的亲和力。

图7 MG、LMG和CV在两种聚合物上的吸附量比较Fig.7 The selective recognition property of each compoundwith Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)and Fe3O4@SiO2-NIPs

2.3 实际样品中孔雀石绿的富集与检测

分别对养殖水和虾肉进行加标，结果表明，未经Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)富集的样品均无法检测到MG的特征峰（如图8A和图9A所示）。经Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)富集后，均能够明显观测到MG的几个特征拉曼峰 （如图8B和图9B所示）。养殖水和虾肉中MG的检测限分别达到0.5 ng/mL和 6 ng/g。

图8 养殖水加标0.5 ng/mL MG富集前(A)及富集后(B)的SERS谱图Fig.8 The SERS spectra of 0.5 ng/mL MG in aquaculture water before(A)and after(B)enrichment

图9 虾肉提取液加标6 ng/g MG富集前(A)及富集后(B)的SERS谱图Fig.10 The SERS spectra of 6 ng/g MG in shrimp extraction before(A)and after(B)enrichment

3 结论

该文结合分子印迹和磁性纳米技术制备了具有核壳结构的磁性分子印迹聚合物Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)，一系列结构表征和吸附性能实验，表明所制备的磁性分子印迹聚合物对MG具有优异的分子识别能力和良好的选择性吸附性能。比较Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)对养殖水和虾肉样品中MG富集前后的SERS响应情况，结果表明Fe3O4@SiO2-MIPs(MG)具有卓越的富集能力，实现养殖水和虾肉中MG的高效富集，所建立的快速检测方法具有广阔的应用推广前景。

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